线虫丁香园

『壹』 请大家给我推荐有关于RNAi的文章，最好是免费的中文的感谢大家！

http://www.bbioo.com/Soft/2005/95.htm 这是个PPT
文章：
http://hi..com/miaobio/blog/item/f3984e908cb6348da877a42b.html

RNAi技术初探
2006-11-04 14:14BIOX.CN 2005-4-11 10:58:00 来源：丁香园

RNA干扰(RNA interference， RNAi)是近年来发现的研究生物体基因表达、调控与功能的一项崭新技术，它利用了由小干扰RNA(small interfering RNA， siRNA)引起的生物细胞内同源基因的特异性沉默(silencing)现象，其本质是siRNA与对应的mRNA特异结合、降解，从而阻止mRNA的翻译。RNAi是生物进化的结果，是生物体对病毒基因等外源核酸侵入的一种保护性反应。它普遍存在于各种生物，具有抗病毒、稳定转座子及监控异常表达mRNA的生物学功能。RNA干扰现象不仅能提供一种经济、快捷、高效的抑制基因表达的技术手段，而且有可能在基因功能测定，基因治疗等方面开辟一条新思路。

1 RNAi的历史背景
20世纪20年代，人们发现，植物受到野生型病毒感染后，能产生对另一种亲缘关系相近的病毒的抵抗力。而真正发现双链RNA(dsRNA)能引起基因沉默现象，则在1995年。当时，Guo和Kemphues用反义RNA技术阻断秀丽新小杆线虫(C.elegans)中parl基因的表达时发现反义RNA具有抑制该基因表达的功能，同时正义RNA也同样出现了类似的抑制效应，实验表明正义RNA和反义RNA均能阻抑基因功能表达，而且两者的作用是相互独立的，机制也各不相同。1998年，Fire和Mello等人首次发现dsRNA能够特异地抑制C.elegans中的纹状肌细胞unc-22基因的表达，结果发现dsRNA所引起的基因沉默效应要比单单应用反义RNA或正义RNA强十几倍。而且注射入C.elegans的性腺后，在其第一子代中也诱导出了同样基因的抑制现象，说明在原核生物中，RNAi具有可遗传性。他们将这一现象称为RNAi。因为RNAi作用发生在转录后水平，所以又被称为转录后基因沉默(PTGS)或共抑制。
此后，又在果蝇、锥虫、涡虫、无脊椎动物、脊椎动物、植物、真菌、斑马鱼及哺乳动物等真核生物中发现了RNAi现象。不同领域中的发现促使人们思考它们之间的可能联系。RNAi在果蝇中得到证实的同时，发现转座子翻转移位可启动RNAi，而转座子翻转移位所造成的同源基因沉默很似植物中的共抑制；在线饱霉实验中，发现PTGS过程中所必须的蛋白QDE1与RNA依赖的RNA聚合酶(RdRp)同源，提示PTGS过程中可能涉及到RNA复制及调节作用。同样在植物韧皮部注射dsRNA可遍及扩散到整个植株体产生RNAi；更有趣的是，把线虫浸润到含有dsRNA液体中或喂养表达dsRNA的工程菌也可以诱发RNAi。这种存在揭示了RNAi很可能是出现于生命进化的早期阶段。随着研究的不断深入，RNAi的机制正在被逐步阐明，而同时作为功能基因组研究领域中的有力工具，RNAi也越来越为人们所重视。

2 RNAi的作用机理
目前对RNAi的作用机理尚不清楚， RNAi是由dsRNA诱导的多步骤、多因素参与的过程，属于基因转录后调控，其中需要ATP的参与。通常认为dsRNA由核酸内切酶(RNA se Ⅲ)切割成21～23bp的siRNA (在果蝇RNA se Ⅲ 被称为 dicer)，siRNA再与体内一些酶(包括内切酶、外切酶、螺旋酶)结合形成RNA诱导的沉默复合物RISC，然后RISC再特异性地与mRNA的同源区结合，通过酶的作用使mRNA降解，而产生基因沉默。靶mRNA被破坏后， RISC还可以再作用于其它靶分子。siRNA还具有低分子质量、低浓度、沉默信号可在细胞间传递甚至传播至整个有机体以及可遗传等特点。而大于30bp的dsRNA可引起机体非特异性干扰素样反应和蛋白激酶(PKP)的激活而使其被降解，从而大大减少了其对mRNA的抑制作用。

3 RNAi的特点
RNAi被美国科学杂志评为2001年十大科技突破之一，科学家对RNA干扰现象之所以表现出极大关注在于RNA干扰在基因功能和相关方面的研究中具有许多传统方法无法比拟的特点和优势。RNAi有7个重要特征
3.1 RNAi是dsRNA介导的PTGS机制
在此过程中，注射该基因的内含子或者启动子顺序的dsRNA都没有干涉效应。翻译抑制剂对RNAi不产生影响。
3.2高特异性
RNAi只能特异地降解与之序列相应的单个内源基因的mRNA，而其他mRNA的表达则不受影响。
3.3高效性
无论是在体内还是体外实验中，仅需少量的dsRNA(几个数量级浓度)就能有效的抑制靶基因表达，抑制的效率在低等动物中>90%。这表明dsRNA介导的RNA干扰是一个以催化放大的方式进行的。
3.4 dsRNA长度限制性
引发有效iRNA的dsRNA需要一个最小的长度。dsRNA小片段如小于21～23nt(如10～15nt)，特异性将显著降低，不能保证不与细胞内非靶向基因相互作用，如远远大于21～23nt，互补序列可能延伸，超出抑制范围。
3.5 RNAi有浓度、时间双重依赖性
dsRNA诱发的RNAi效应的强度随着其浓度的增高而增强。高浓度的dsRNA产生较多的siRNA，不仅能增强反应体系的效应，而且还能抵消ADARs(RNA依赖的腺苷脱氨酶)的作用。实验表明，RNAi在哺乳动物细胞中只能维持一段时间，干扰效应通常出现在注射dsRNA 6h后，可持续72h以上。
3.6可传播性
基因表达的效应可以跨越细胞界限，在不同细胞甚至生物体间长距离传递和维持，并可传递给子一代。
3.7 ATP依赖性
在去除ATP的样品中RNA干扰现象降低或消失显示RNA干扰是一个ATP依赖的过程。可能是Dicer和RISC的酶切反应是必须由ATP提供能量。

4 RNAi技术的应用与展望
依据RNA干扰现象，科学家建立了RNA干扰技术，即人为设计合成针对某特定基因序列的dsRNA来关闭或抑制该基因的表达。但RNA干扰已被证实是一种特异、高效、经济的使基因表达受抑的技术手段。它可有效地将靶基因的表达水平降到一个低的水平，甚至于完全的清除。美国麻省理工大学医学中心Phillip Zamore预言“RNA干扰将在哺乳动物细胞遗传学上引起革命性的变化。”人们不再需要花6个月的时间设法去关闭某个基因的表达，利用这项技术，可以在一周之内就可关闭10个基因。
4.1 RNAi技术可发挥重要的作用
4.1.1研究基因功能
与使用基因敲除技术来检测基因功能相比，RNAi技术却能方便，快捷的达到这一目的，即使是在一般条件的实验室也可开展这项工作。利用RNAi技术，科学家已对几乎全部线虫基因(大约19000个基因) 功能进行分析检测。Wianny也报道用dsRNA来阻断小鼠早期胚胎特异基因，包括卵母细胞的c-mos和早期胚胎E-cadherin及GFP转基因的表达。
4.1.2抗病毒作用
我们可将病毒在复制中起关键作用的基因作为目标设计dsRNA来抑制病毒的复制。自1986年植物学家首次利用转入烟草花叶病毒(TMV)的核衣壳(CP)基因导入植株培育出抗病毒植株后，已培育了一大批抗病毒植株。
4.1.3研究转基因沉默机制
在植物的转基因试验中，经常发生基因沉默。因此，对转基因沉默机制的探索可以为在转基因研究中避免基因沉默提供对策。
4.1.4基因治疗
RNAi作用的高度特异性有可能特异地抑制致病的等位基因的表达而达到治疗目的，但又不影响正常等位基因。Wilda等在白血病细胞K562试验中，用对M-BCR/ABL融合基因特异的siRNA转染K562细胞，发现K562细胞中相应的mRNA被清除，并出现强烈的细胞凋亡现象。
4.2 发展前景
通过实验手段将dsRNA分子导入细胞内，特异性地降解细胞内与其序列同源的mRNA，封闭内源性基因表达，从反向遗传的角度研究人类或其他生物基因组中未知基因的功能。近来也有实验报道通过RNAi研究细胞内脂质平衡过程中涉及的各条途径。在这之前，曾利用反义RNA与靶mRNA序列互补的特性来抑制其表型的发生，但由于反义RNA对内源性表达的基因抑制作用较弱，往往会产生一些过渡表型，易造成对基因功能判断错误，目前已通过审批认为临床上具有治疗作用的仅有一种药物——Vitravene。RNAi技术与之相比，特异性更高，作用更迅速，副反应小，在有效地沉默靶基因的同时，对细胞本身的调控系统也没有影响。
几乎所有包含已知基因编码序列的dsRNA都能够在体外特异性抑制该基因的功能，类似于基因敲除的效果，基于这些特点，RNAi已被发展成一种探查基因功能的有力工具。线虫中，通过RNAi检测单个基因功能的分析方法现已扩展为分析整个蠕虫中存在的19000个基因功能的一种有效方法。相似的策略在植物及其它生物中也得到应用。

作者：蔡军 黄雪梅（浙江省湖州师范学院生命学科学院 313000）

『贰』 micro RNA二级结构

RNA干扰及其应用进展
孙德惠1,2,才学鹏1*,常惠芸1 ,独军政1
(1.中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室农业部畜禽病毒学重点开放实验室,甘肃兰州 730046;2.甘肃农业大学动物医学院,甘肃兰州 730070)

摘 要:RNA 干扰(RNA interference,RNAi)是一种由双链RNA介导的基因沉默现象.RNAi主要发生在核外,RNAi具有操作简便快速等特点.RNAi现象自发现至今已逾10年,在此期间,已将研究重点由机理研究转向应用研究.文章以RNAi的应用为重点,从RNAi的起源,可能的作用机制,作用特点,研究方法,应用前景及展望等方面进行了综述.
关键词:RNA干扰;双链RNA;基因沉默
RNAi是Napoli C D等[1]在试图向紫色矮牵牛花转导色素合成基因,用以增加其花色时发现的.结果出乎预料,转基因的植株不仅没有新基因的表达,反而自身的色素合成也减弱了,一些转基因的花出现了全白色或部分白色.他们把这种导入的基因未表达和植物本身合成色素基因的失活现象命名为共抑制(cosuppression).之后,Ramano等在向粗糙孢菌�(Neurospora crassa)�中导入合成胡萝卜素的基因时造成失活,他们称为基因静止(quelling).Guo S等[2]发现正义RNA与反义RNA有相同水平的抑制效应,但未能就此现象给出合理的解释.Fire A等[3]在研究反义核苷酸时发现在线虫体内,双链RNA( double stranded RNA,dsRNA)能有效地抑制有互补序列的内源性基因,且抑制效果优于单链反义RNA.至此,正式提出了双链RNA诱导的RNAi的概念,开启了RNAi研究的序幕.
1 RNAi可能的作用机制及特点
1.1 RNAi的作用机制
虽然RNAi作用的确切机制尚不清楚,但目前普遍认可是Bass假说.具体概括为三个阶段.
(1)起始阶段.在细胞内,双链RNA(dsRNA)由核酸酶Ⅲ(RNaseⅢ) Dicer 在ATP的参与下被处理为21个～23个碱基的小RNA,即小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA).siRNA是由19个～21个碱基配对形成的双链,并在其3′末端有两个游离未配对的核苷酸.研究发现, siRNA 是RNAi 作用发生的重要中间分子,序列与所作用的靶mRNA 的序列具有高度同源性;双链的两端各有2个～3个突出的非配对的3′碱基;两条单链末端为5′端磷酸和3′端羟基.这些是细胞赖以区分真正的siRNA和其他双链RNA的结构基础. 研究表明,平末端的siRNA 或失去了5′磷酸基团的siRNA 不具有RNAi 的功能[4]
(2)引发阶段.siRNA与Argonaute蛋白家族及其他未知因素结合,形成siRNA-核蛋白复合物(siRNA-ribonucleoprotein complex,siRNP).siRNP在ATP及其他未知因素参与下,使双链siRNA解旋形成RNA诱导的沉默复合物(RNA incing silencing Complex ,RISC).RISC可能以完全单链或两条链解旋但不完全分离的形式存在,继而RISC在dsRNA的介导作用下与互补mRNA结合,并将其降解.mRNA被降解在转录后水平,抑制基因表达,因而又称之为转录后基因沉默( posttranscriptional gene silencing,PTGS)
(3)循环放大阶段.在siRNA诱导的RNAi过程中,可能还存在siRNA 的循环放大过程,以维持它的RNA诱导功能.此过程推测是以siRNA为引物,互补mRNA 为模板,在RNA依赖性RNA合成酶(RNA-dependent RNA Polymerase,RdRP) 的作用下,合成新的双链RNA,再由Dicer作用,产生新的siRNA,完成siRNA 的放大过程,开始新的RNAi循环[5].
关于对RNAi机制中重要酶的作用研究,Zamore P D等[6]发现,21 nt RNA指导mRNA的降解; Scharf W D等[7]发现ATP依赖的RNA解旋酶为Mut6;Grishok A等[8]发现Let-7和lin-4为内源性的RNAi基因(stRNA);Dalmay T等[9]提出RNA依赖的RNA多聚酶就是SDE-1; Bernstein E等[10]证实RNaseш样的核酸酶为Dicer; Elbashir S M等[11]应用外源性21 nt-siRNA能够抑制同源mRNA的表达;Novina C D等[12]证实无论是针对病毒感染细胞所需的CD4受体,还是针对病毒基因组的gag区域,siRNA都可以有效地使病毒与细胞的基因沉默,抑制HIV的感染与复制.
1.2 RNAi的作用特点
(1)"共抑制"性.RNAi是双链RNA介导的转录后基因沉默机制,它的启动子相当活跃,外源基因可以转录,但不能正常积累mRNA;RNAi作用不仅使外源基因在转录后水平上失活,同时诱导与其同源的内源基因沉默.
(2)高效性.试验证明双链RNA干扰mRNA 翻译的效率比单纯反义或正义RNA 的抑制效率提高了几个数量级;RNAi可在低于反义核酸几个数量级的浓度下,使靶基因表达降到很低水平甚至完全"剔除",而产生缺失突变体表型.它比基因敲除技术更为便捷,科学家称RNAi技术为靶基因或靶蛋白的"剔降"(knockdown).
(3)高特异性.由dsRNA降解成的小干扰RNA,除其正义链3′端的两个碱基在序列识别中不起主要作用外,其余碱基在序列识别中都是必需的,单个碱基的改变即可使RNAi失效,RNAi能特异性降解mRNA,针对同源基因共有序列的RNAi则可使同源基因全部失活.
(4)高穿透性.RNAi具有很强的穿透能力,能在不同的细胞间长距离传递和维持,如在含有双链RNA的溶液中,喂食表达双链RNA的细菌等,能向秀丽隐杆线虫导入双链RNA.
(5)"遗传性".已在线虫中观察到RNAi效应通过生殖系传递到后代,说明RNAi具有一定的可遗传性.
(6)高稳定性.细胞中可能存在天然的稳定siRNA的机制.此机制可能是siRNA与某种保护性蛋白结合,从而使其具有相对的稳定性,这些双链RNA 不像反义核酸那样需要多种化学修饰来提高其半衰期.
(7)双干扰系统.哺乳动物中存在有非特异性干扰和特异性干扰两条独立的途径. 非特异性干扰反应是由大于30个碱基对的双链RNA介导,导致整个细胞中非特异性蛋白合成抑制,RNA降解;特异性反应由21 bp～25 bp的小干扰RNA介导,可逃避非特异性干扰系统的"监控",只降解与其序列相应的单个基因的mRNA[11].
2 研究方法
在研究过程中,科研人员逐渐摸索总结出了成套的研究方法.目前,展开RNAi操作主要有两种方法.一种为直接将靶向特定基因的大约21个碱基长短siRNA,或45个~50个碱基的发夹结构RNA(small hairpin RNA,shRNA)转染到细胞,shRNA在细胞中会自动被加工成siRNA,从而引发基因沉默或表达抑制.另一种为构建特定的siRNA表达载体,通过质粒在体内表达siRNA而引发基因沉默.此法的优点是排除了RNA酶干扰,延长siRNA半衰期.更重要的是,该法可以进行稳定表达细胞株的筛选,且随着质粒复制扩散到整个机体,基因抑制效果可传代.试验表明,可被化学合成或体外合成的siRNA抑制的基因同样可被表达相同序列的载体表达出的siRNA所抑制.
3 RNAi的应用
3.1 基因功能研究
在神经生物学研究中,科学家们通过siRNA表达质粒对中脑腹侧神经细胞中的多巴胺能相关基因进行了有效抑制,还通过病毒介导的RNAi建立了此类成年小鼠模型,不仅为建立神经系统的功能缺失模型找到了一些有价值的表型标记,对神经系统的基因治疗也有一定借鉴意义;在癌症研究中,通过shRNA表达载体成功抑制成年大鼠脑癌基因,同时对RNAi的远程(穿过血脑屏障)基因沉默方法进行了非常有益的探索;利用细胞凋亡途径,通过RNAi抑制凋亡基因Caspase-8能提高患急性肝功能衰竭小鼠的成活率,并发现Caspase 8 siRNA处理对特异性Fas激活剂(Jo2和AdFasL)和野生型腺病毒介导的急性肝功能衰竭都有效,表明这个动物模型能反应人类急性病毒肝炎多分子参与的机制,增强了siRNA用于急性肝炎病人治疗的希望.除了对某些关键基因的RNAi研究外,还在哺乳动物细胞中探索了siRNA在基因组水平上的筛选方法.他们建立了一个包含8 000多个基因的siRNA表达框文库阵列,通过它来高通量筛选NF-kB信号途径中已知的及Unique基因.由此可见,RNA干扰也正作为筛选成百甚至上千基因的工具,发挥着越来越大的作用[13].RNAi为系统地抑制RNA分子合成蛋白提供了快速而相对简便的途径.通过在一段时间内对一个基因RNA信号的抑制,研究者可以深入研究基因功能,进而描绘支配从细胞形态到信号系统的遗传网络.
3.2 基因治疗及药物筛选探索
由于RNAi是针对转录后阶段的基因沉默,相对于传统基因治疗对基因水平上的敲除,整个流程设计更简便,且作用迅速,效果明显,为基因治疗开辟了新的途径.其总体思路是通过加强关键基因的RNAi机制,控制疾病中出现异常的蛋白合成进程或外源致病核酸的复制及表达.尤其针对引起一些对人类健康严重危害的病毒,如2003年在全球多个国家和地区流行的SARS,病原体是单链核酸的新型冠状病毒,寻找药物靶点,设计核酸药物就更为方便.目前已经有很多公司在积极开发这方面的药物,如在SARS药物研究中一鸣惊人的美国俄勒冈州的AVI BioPharma生物制药公司等.国内也有很多研究机构及生物技术公司投入了这方面的工作.如上海生科院成立了SARS防治科研攻关小组,其中生化细胞所和药物所的一些课题组在从RNAi的角度努力.此外,北京大学,中南大学,北京动物所等大专院校和研究机构,以及北京金赛狮反义核酸技术开发有限公司等,也开展了RNAi药物的研究与开发.
基因治疗方面最引人注目的进展之一是对肝炎病毒的RNAi研究.Mccaffrey A P等通过表达shRNA的载体在细胞水平和转染HBV质粒后免疫活性缺失的小鼠肝脏中成功抑制了HBV复制.与对照相比,小鼠血清中测得的HBsAg下降了84.5%,免疫组化对HBcAg的分析结果下降率更超过99%.哈佛大学Lieberman研究小组通过注射针对Fas的siRNA,过度激活炎症反应,诱导小鼠肝细胞自身混乱.然后给测试小鼠注入 Fas hyperdrive的抗体,发现未进行siRNA处理的对照组小鼠在几天中死于急性肝功能衰竭,而82%的siRNA处理小鼠都存活下来,其中80%~90%的肝细胞结合了siRNA.并且,RNAi发挥功能达10 d,3周后才完全衰退.由于Fas很少在肝细胞外的其他细胞高水平表达,它对其他器官几乎没有副作用.此外,这个小组还和其他研究者积极开展针对HIV的RNAi测试,目前报道他们使用的针对CCR5蛋白的siRNA能阻止HIV进入免疫细胞约3周,在已经感染的细胞中也能阻止感染病毒的复制.
然而,尽管取得了不少研究成果,但要真正用于医疗还需时日.目前大多数还停留在小鼠测试阶段,siRNA的导入多采用静脉或腹腔注射,尾部注射,细胞移植等,如何对人进行有效的给药,既能确保药效在靶器官靶组织有效释放,还要具有高度安全性等问题都需进一步研究.人们期待着RNAi引领的新医学革命的到来.
在药物筛选领域,除了线虫这种低等动物的RNAi高通量药筛模式外,Lavery K S等对RNAi在药筛领域的应用前景进行了高度评价,RNAi技术将逐渐成为药物靶点筛选和鉴定的强大工具.他对如何在药筛的各个阶段应用RNAi做了具体描述及展望,并指出将这项技术与高通量筛选,体外生物检测和体内疾病模式相结合,将提供大量基因功能方面的有用信息,在药物开发过程的多个阶段促进靶点的有效筛选.
3.3 抗肿瘤治疗
多种癌基因可以作为靶点设计相对应siRNA[14].Brummelkamp T R等[15]用逆转录病毒载体将siRNA 导入肿瘤细胞中,特异性抑制了癌基因K2RAS (V12)的表达.对急性髓性白血病的研究已经取得了较好的结果.Scherr M等[16]以引起慢性髓性白血病和bcr2abl阳性急性成淋巴细胞白血病的bcr2abl癌基因为靶基因,设计了对应的siRNA,并获得了87% 的有效抑制率.Wilda M等[17]用siRNA抑制白血病BCR/ABL融合基因表达也取得了成功. 因此,基于RNAi 技术的抗肿瘤治疗药物开发潜力巨大.有报道称,一种全新生物工程药品"RNA干扰剂"(非干扰素)业已浮出水面,并有望在3年内上市.经过多年的探索,科学家终于发现,在癌细胞和病毒RNA的22对碱基中有1对碱基专门负责复制工作,只要能使这对碱基"休眠",癌细胞或病毒就会自动停止复制.这一重要发现为一种全新药物——RNA干扰剂奠定了基础.科学家们相信,艾滋病,乙型肝炎,恶性胶质瘤(恶性脑瘤)和胰腺癌等疾病有望成为RNA干扰剂的第一批受益者(2004年经FDA批准已开始RNA干扰剂的临床试验),艾滋病,中枢神经系统退行性病变疾病如多发性硬化症,阿尔茨海默病,帕金森病等将成为第二批受益者.
3.4 抗病毒治疗
由于RNAi 是机体中古老而天然的抗病毒机制,目前国外科技人员利用此特点,已设计出针对HIV gag,tat,rev,nef等基因的siRNA,针对丙型肝炎病毒非结构蛋白5B基因的siRNA,针对脊髓灰质炎病毒衣壳蛋白和多聚酶基因的siRNA,针对口蹄疫病毒3D片段siRNA等[18],均在试验中取得理想结果.陆续有关通过RNAi抑制其他病毒在细胞内复制的报道如呼吸道合胞病毒,人乳头瘤病毒,乙型肝炎病毒,丙型肝炎病毒[19]等,国内也已设计出针对口蹄疫病毒VP1基因的siRNA,针对丙型肝炎病毒5′保守区的siRNA,针对口蹄疫病毒IRES和L串联序列两侧的保守区的siRNA[20],针对SARS冠状病毒的6个siRNA,即RL001,R L002,RL003,RL004,RL005和RL006,均已取得理想结果.针对病原的siRNA已经进行到动物实验阶段[21],向病毒病的有效防治迈出了坚实的一步.由此可见,利用RNAi技术将使病毒病的有效治疗成为可能.
3.5 转基因研究
在动植物的转基因试验中, 经常发生基因沉默.因此, 对转基因沉默机制的探索可以为在转基因研究中避免基因沉默提供对策.在转基因植物研究中避免基因沉默可提高试验成功率,且节省时间,而在大型动物转基因研究中避免基因沉默可节约成本,提高产率.
3.6 干细胞研究
在干细胞研究方面,在dsRNA阻断大鼠骨髓源性神经干细胞 Hes5表达的试验中[22],观察外源性短dsRNA在转录后水平mRNA水平降低基因表达的效率,并对其影响因素进行了初步探讨.同时基于干细胞可能拥有自己的一套基因组,不同类型的干细胞又拥有各自所特有的基因,这些基因可能是决定干细胞特性的最关键的实质性因素.因此,RNAi技术在此领域应用空间广阔.
3.7 研究信号传导的新途径
Biotech认为,联合利用传统的缺失突变技术和RNAi技术可以很容易地确定复杂的信号传导途径中不同基因的上下游关系,Clemensy等应用RNAi研究了果蝇细胞系中胰岛素信息传导途径,取得了与已知胰岛素信息传导通路完全一致的结果.RNAi技术较传统的转染试验简单,快速,重复性好,克服了转染试验中重组蛋白特异性聚集和转染率不高的缺点,因此认为RNAi技术可能成为研究细胞信号传导通路的新途径.
3.8 常见病的治疗
Nature杂志报道了miRNA(Micro RNA)的应用上一个重要发现,成功采用miRNA调节了胰岛素的分泌,这为糖尿病的治疗带来新的希望,也将为糖尿病的新药研究带来新的曙光和思路.据Sicence杂志报道,显示应用RNAi技术可有效降低血管内胆固醇含量,对治疗心血管疾病有明显的作用.
4 展望
综上所述,RNAi技术在基因功能研究,抗肿瘤治疗,抗病毒治疗,基因应用研究,常见病的治疗等许多方面都是强有力的工具和手段.同时做为新兴的生物技术,还有广阔的研究和应用空间期待着科研人员的探索.例如,siRNA在病毒持续性感染过程中扮演怎样的角色 siRNA在冬眠动物体内的作用如何 RNAi在雀斑形成中起到怎样的作用 如上述问题得到解决,将进一步依据其机理及特点,有望应用于病毒持续性感染的鉴别诊断及治疗,利用siRNA在冬眠动物体内的作用进行星际航行,以解决能量供应及时间跃迁问题,RNAi应用于祛除雀斑等.
尽管在RNAi方面的研究已取得许多突破性进展,尤其是哺乳动物细胞中的研究的报道逐渐增多,但由于RNAi机制尚未完全阐明,仍有许多问题尚未得到彻底解答.例如,siRNA 在哺乳动物细胞中抑制mRNA表达是有效的, 但达不到果蝇细胞那样的高抑制率, 可能是因为生物进化水平越高,调控基因表达系统的复杂程度相应的越高,多种抑制机制间相互作用的频率也越高,抑制作用受到的影响因素也就越多.另外, 在哺乳动物中,RNAi能否成功地抑制基因表达以及抑制的程度还取决于细胞类型.对线虫来说,可以采用注射,浸泡或喂食的方法转入dsRNA,而对哺乳动物来说,寻找高效的方式来转入siRNA以及快速的方式来筛选siRNA仍在进一步探索中.RNAi在抗病毒感染中的应用令人鼓舞, 但要取得最终的成功还有很漫长的路要走.其中一个关键的原因是siRNA并不能对所有病毒RNA发生作用,有些病毒靶序列可能隐藏在二级结构下, 或者位于高度折叠的区域中, 而有些病毒序列可能与蛋白质形成紧密的复合物, 阻碍了与siRNA 的识别.因此,不仅要选合适的靶序列,而且需要反复试验.另一个重要的原因是病毒子代的突变率较高, 这使病毒可逃避siRNA 的识别.为了克服这个障碍,所选病毒RNA的靶序列必须是高度保守的, 或者设计数对siRNA同时作用[23].
总之,RNAi作为一种新发展起来的分子生物学技术,不可避免地会存在潜在的问题,这就要求研究者在利用该技术时要考虑到生物安全性等诸多问题,以使RNAi技术更好地为人类服务.
参考文献(略)

『叁』 从眼睛里挑出线虫,据说是由宠物传播的,是真的吗

存在这样的寄生虫结膜吸吮线虫 (Thelazia callipaeda)结膜吸吮线虫于1910年首次被发现,是一种专门寄生于狗、牛等动物眼睛里的寄生虫,也可寄生于人的眼睛中,由此虫感染的疾病叫结膜吸吮线虫病,是一种罕见的人畜共患疾病。由于该病多发生于亚洲地区,故称为东方眼虫病。人眼寄生了结膜吸吮线虫后,轻者导致眼睛刺痒、有异物感,重者造成眼内感染,甚至失明。//摘自丁香园的一篇 文献介绍 ,里面也提供了lancet上的一例病例报道传播途径是某些果蝇,比如冈田绕眼果蝇Phortica okadai
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