丁香園質控

Ⅰ 請教：肝昏迷的診斷標準是什麼血氨的測定在其診斷中所處的地位在應激狀態下，血氨是否會升高

在急性肝炎病情發展階段，如出現神志改變或昏迷，則診斷比較容易。如肝硬化患者有明顯肝功能失代償的症狀，或病史中有過門靜脈分流手術，或近期有上消化道大量出血、感染、大量利尿、應用麻醉鎮靜葯等誘因，肝性腦病的診斷也不難作出，此時如發現撲擊樣震顫和血氨增高，則可以肯定診斷 空腹動脈血氨比較穩定可靠，慢性肝性腦病尤其是門體分流性腦病多有血氨升高；急性肝衰竭所致的腦病，血氨多正常。 polanyi丁香園榮譽會員 -------------------------------------------------------------------- 同意kepple的意見。補充幾點： 1、所問為肝昏迷還是肝性腦病？hepatic coma和hepatic encephalopathy（HE）在概念上還是有所不同。後者大於前者，按伏答West Haven criteria分的0-4級，若有coma，已經是4級肝性腦病。此時，按kepple所提診斷依據較好。 2、若有已知有明確肝硬化或門脈高壓及門體分流的基礎，或急性肝衰竭，加上進展性腦病表現，撲擊樣震顫陽性，肝性腦病已可臨床診斷。血氨增高有利於門體分流性HE診斷。 3、subclinical hepatic encephalopathy(SHE)在肝硬化患者中的發生率約30-84%。SHE由於通常僅有有智力檢測和誘發電位的異常，而無腦病臨床表現，常規的精神和神經功能檢查正常。因此很容易被忽略。腦誘發電位不知道你那裡有沒有做。如果沒有的話可使用一些智力測試試驗，如數字連接試驗、圖畫連接、數字元號試驗和搭積木試驗等來代替。雖然SHE還沒有統一的標准，一般來說，智力試驗及腦誘發電位中有一項以上異常者可以診斷SHE。特別要注意對有肝硬化或TIPPS等門體分流基礎的患者，若智力試驗提示異族廳纖常，還是可以用乳果糖等進行試驗性治療的。 4、關於血氨測定，檢測質控非常重要。對於診斷有幫助，但對隨訪價值不如神經精神異常評估。 5、要除外其他可能的腦病原因，如代謝、感染、腦實質病變等。 polanyi 丁香園榮譽會員 -------------------------------------------------------------------- 血氨在應激狀態下應該不會，尤其在肝功能尚可代償的條件下，血氨的清除還是很迅速的。 xiule 修樂 丁香園准中級站友 --------------------------------------------------------------------- 血氨在肝性腦病病人的診斷中並不是一個很好的診斷方法。有研究指出，並不是每位病人的血氨水平都升高；經過治療，血氨降低，病人的情況也並不見得好轉。 littleboy 丁香園准中級站友 --------------------------------------------------------------------- 個人認為血氨對HE沒有多少價值，臨床肝硬化患者血氨與HE的相關性不是很好。但是我們可以認為血氨升高可能會影響腦細胞代謝而引起腦功能障礙，不過不一定是肝源性的血氨升高。 孤獨求教 -------------------------------------------------------------------- 肝昏迷一定要有肝病基礎，血氨不能作為確診依據。 zl9841 -------------------------------------------------------------------- 同意孤獨的意見。 fdj0289 ------------------------------------------------------------------- 肝功能正常並能完全排除HE，尤其該患有血氨異常，請注意有無特發的門體分流兆仿情況。 wolf7174 我們科有許多的肝性腦病的病人，血氨並不升高，但患者出現腦病症狀，經治療後症狀好轉，血氨有時可有所上升。我個人認為血氨對肝性腦病無診斷意義。

Ⅱ 醫學生畢業後如果不當醫生還可以做些什麼

1. 做醫學科普。比如漫畫啦，或者寫科普文章啦，考個營養師證什麼的，做做與大眾息息相關的東西。

2. 醫學律師。目前國內這一塊很缺乏，你可以幫醫院打官司，也可以幫病人。

3. .私人診所。這個比較難了，需要經驗，而且，各種執照什麼的也挺難辦的。

4. 去做醫葯代表。

5. 去做醫托。在你曾經待過的醫院有一定的人脈，可以帶人看病，幫人預約檢查，掛專家號，給人做醫療方面的解答啦。
   
   
   

Ⅲ 進口葯品批件如何辦理

上丁香園問吧 此處專業人士少

進口葯品管理辦法
(國家葯品監督管理局令第6號)
第一章 總 則
第一條 為加強進口葯品的監督管理，保證進口葯品的質量和安全有效，根據《中華人民共和國葯品管理法》的規定，制定本辦法。
第二條 國家對進口葯品實行注冊審批制度。進口葯品必須取得中華人民共和國國家葯品監督管理局核發的《進口葯品注冊證》，並經國家葯品監督管理局授權的口岸葯品檢驗所檢驗合格。
第三條 國家葯品監督管理局主管進口葯品的審批和監督管理工作，地方各級葯品監督管理部門主管轄區內進口葯品的監督管理工作。
第四條 進口葯品必須符合《中華人民共和國葯品管理法》和中國其它有關法律法規的規定，必須接受國家葯品監督管理局對其生產情況的監督檢查。
第五條 進口葯品必須是臨床需要、安全有效、質量可控的品種。
第二章 申報和注冊審批
第六條 申請注冊的進口葯品必須獲得生產國國家葯品主管當局注冊批准和上市許可。
第七條 進口葯品的生產廠必須符合所在國葯品生產質量管理規范和中國葯品生產質量管理規范（GMP）的要求，必要時須經國家葯品監督管理局核查，達到與所生產品種相適應的生產條件和管理水平。
第八條 進口葯品注冊，須由國外製葯廠商駐中國的辦事機構或其在中國的注冊代理提出申請，填寫《進口葯品注冊證申請表》，連同本辦法規定的資料，報國家葯品監督管理局審批。
國外製葯廠商駐中國的辦事機構或其在中國的注冊代理必須是在中國工商行政管理部門登記的合法機構。
第九條 申請進口葯品注冊，須報送以下資料：
（一）葯品生產國國家葯品主管當局批准葯品注冊、生產、銷售、出口及其生產廠符合葯品生產質量管理規范（GMP）的證明文件和公證文件。
（二）國外製葯廠商授權中國代理商代理申報的證明文件，中國代理商的工商執照復印件；國外製葯廠商常駐中國代表機構登記證復印件。
（三）葯品專利證明文件。
（四）葯品生產國國家葯品主管當局批準的葯品說明書。
（五）葯品質量標准和檢驗方法。
（六）葯品各項研究結果的綜述。
（七）葯品處方、生產工藝、葯理、毒理及臨床研究等詳細技術資料。
（八）葯品及包裝實樣和其他資料。
申報資料的具體要求，按照本辦法所附《進口葯品申報資料細則》（附件一）的規定執行。
第十條 申請注冊的進口葯品，必須按照本辦法所附《進口葯品質量復核規則》（附件二）的要求和程序進行質量復核。
第十一條 申請注冊的進口葯品，必須按照國家葯品監督管理局規定的程序和要求在中國進行臨床研究（包括生物等效性試驗）。其中申請注冊的原料葯若中國尚未生產，則應用該原料葯製成的制劑在中國進行臨床研究。臨床研究須按照中國《新葯審批辦法》及《葯品臨床試驗管理規范》（GCP）的規定執行。特殊病種或其它情況需減免臨床研究的，需經國家葯品監督管理局審查批准。
第十二條 申報品種的質量復核和臨床研究結束後，國家葯品監督管理局對有關資料進行審查，符合要求的，核發《進口葯品注冊證》。該品種的質量標准即成為進口葯品注冊標准，中文說明書為指導進口葯品在中國臨床使用的法定說明書。
第十三條 對特殊病種的治療葯物，在中國尚沒有其它替代葯物的情況下，國家葯品監督管理局可採取加快審批措施。
第十四條 中國重大災情、疫情所需葯品，臨床特需、急需葯品，捐贈葯品和研究用樣品等，在尚未取得《進口葯品注冊證》的情況下，可經國家葯品監督管理局特別批准進口。此類葯品僅限在特定范圍內用於特定目的。
第十五條 下列情形之一的葯品，其進口注冊申請將不予批准：
（一）不符合本辦法第六條和第七條規定的；
（二）申報資料不符合中國進口葯品注冊審批要求的；
（三）臨床使用中存在嚴重不良反應的；
（四）臨床療效不確切或所報臨床研究資料無法說明葯品的確切療效的；
（五）質量標准及檢驗方法不完善，質量指標低於中國國家葯品標准、中國生物製品規程或國際通用葯典以及已注冊同類品種的企業標準的；
（六）含有中國禁止進口的成份的；
（七）其他不符合中國有關法律、法規和規定的。
第三章 進口葯品注冊證
第十六條 《進口葯品注冊證》是國家葯品監督管理局核發的允許國外生產的葯品在中國注冊、進口和銷售使用的批准文件。國家葯品監督管理局各口岸葯品檢驗所憑《進口葯品注冊證》接受報驗。
第十七條 《進口葯品注冊證》分為正本和副本，自發證之日起，有效期三年。
第十八條 《進口葯品注冊證》按統一格式編號，為注冊證號。注冊證號由字母X（Z或S）後接八位阿拉伯數字組成，前四位為公元年號，後四位為年內順序編號；其中Z代表中葯，S代表生物製品，X代表化學葯品。
第十九條 《進口葯品注冊證》規定以下內容：葯品通用名稱、商品名、主要成分、劑型。規格、包裝規格、葯品有效期；公司、生產廠名稱及地址；注冊證有效期、檢驗標准、注冊證證號、批准時間、發證機關及印鑒等。
批准注冊品種的每個不同規格，分別核發《進口葯品注冊證》；每個《進口葯品注冊證》最多登載二個包裝規格。
第二十條 《進口葯品注冊證》只對載明的內容有效，其任何內容的改變必須報國家葯品監督管理局審核批准。
第二十一條 對部分批准進口注冊的原料葯、輔料、制劑半成品，國家葯品監督管理局將在《進口葯品注冊證》備注中，限定其使用范圍。
第四章 《進口葯品注冊證》的換發和審批
第二十二條 換發《進口葯品注冊證》應由國外製葯廠商駐中國的辦事機構或其在中國的注冊代理在注冊證期滿6個月前，向國家葯品監督管理局提出申請。超過注冊證有效期的按新申請注冊品種管理。
第二十三條 申請換發《進口葯品注冊證》須填寫《換發進口葯品注冊證申請表》，並報送以下資料：
（一）葯品生產國國家葯品主管當局簽發的批准葯品注冊、生產、銷售、出口及符合葯品生產質量管理規范（GMP）的證明文件。
（二）國外製葯廠商授權中國代理商代理申報的證明文件，中國代理商的工商執照復印件；國外製葯廠商常駐中國代表機構登記證復印件。
（三）葯品生產國國家葯品主管當局批準的葯品說明書及其中文譯本。
（四）葯品處方、生產工藝、質量標准及檢驗方法。
（五）《進口葯品注冊證》有效期內在中國進口、銷售情況（包括進口批次、數量、進口口岸等）。
（六）進口葯品使用及不良反應情況的總結報告。
（七）葯品及包裝實樣和其他資料。
申報資料的具體要求，按《進口葯品申報資料細則》的規定執行。
第二十四條 葯品處方中輔料、生產工藝、質量標准和說明書等有變化的，須同時報送以下資料：
（一）修改理由及其說明。
（二）生產國國家葯品主管當局批准此項修改的證明文件。
（三）此項修改所依據的實驗研究資料。
第二十五條 國家葯品監督管理局對申請換發《進口葯品注冊證》的品種進行審查，必要時，可安排質量考核或臨床再評價，符合要求的，批准換發《進口葯品注冊證》，發給新的注冊證號。
第二十六條 有下列情形之一的進口葯品，其換發《進口葯品注冊證》申請將不予批准：
（一）發現嚴重不良反應的；
（二）臨床療效不確切、質量不穩定的；
（三）口岸檢驗二批不合格的；
（四）已被國家葯品監督管理局處罰二次以上的（含二次）；
（五）其他不符合中國有關法律、法規和規定的。
第五章 補充申請
第二十七條 已取得《進口葯品注冊證》的進口葯品，下列情形屬補充申請。
（一）《進口葯品注冊證》註明的通用名稱、商品名、公司名稱、生產廠名稱等改變。
（二）質量標准、生產工藝、有效期等改變。
（三）適應症增加。
（四）說明書內容改變。
（五）包裝和標簽式樣、內容改變。
（六）處方中輔料改變。
（七）產地改換。
（八）葯品規格改變或增加。
（九）包裝規格改變或增加。
（十）其它與批准注冊時申報內容有任何改變的。
第二十八條 補充申請需填寫《進口葯品補充申請表》，連同《進口葯品申報資料細則》規定的補充申請資料，報國家葯品監督管理局審查批准。
第二十九條 申請增加適應症，須在中國進行臨床試驗；葯品質量標准改變的，須進行質量標准復核。
第三十條 改換產地、增加葯品規格的補充申請，必須在原《進口葯品注冊證》有效期滿至少12個月前提交；不足12個月的，可按照本辦法第四章的規定，申請換發《進口葯品注冊證》，同時申請改換產地、增加葯品規格。
改換產地、增加葯品規格的補充申請經國家葯品監督管理局審查批准後，核發新產地、新增葯品規格的《進口葯品注冊證》，新注冊證號為原注冊證號前加字母B構成，注冊證有效期以原注冊證為准。
第三十一條 《進口葯品注冊證》規定內容的補充申請，如變更包裝規格、通用名稱、商品名、公司名稱、生產廠名稱等，國家葯品監督管理局審查批准後，核發新的《進口葯品注冊證》，原注冊證即行作廢，並由國家葯品監督管理局收回；增加包裝規格的補充申請，包括進口分裝生產所需大包裝規格，國家葯品監督管理局審查批准後核發新的《進口葯品注冊證》，原注冊證可繼續使用。
新注冊證號為原注冊證號前加字母B構成，注冊證有效期以原注冊證為准。
第三十二條 進口葯品中文說明書和質量標準的補充申請，經國家葯品監督管理局審查批准後，下發修訂後的說明書和質量標准，原說明書和質量標准即行廢止。
第三十三條 進口葯品的包裝、標簽的式樣和內容僅有微小改變的，應向國家葯品監督管理局申報備案。
第六章 葯品名稱、包裝、標簽和說明書
第三十四條 進口葯品必須使用中文葯品名稱，必須符合中國葯品命名原則的規定。
第三十五條 進口葯品的包裝和標簽，必須用中文註明葯品名稱、主要成分以及注冊證號，進口葯品必須使用中文說明書。
第三十六條 進口葯品的包裝、標簽和說明書，必須符合中國《葯品包裝、標簽和說明書管理規定》，並經國家葯品監督管理局批准後使用。一經批准，其內容不得擅自更改。
第七章 進口檢驗
第三十七條 國家葯品監督管理局根據進口葯品管理工作的需要，設立口岸葯品檢驗所，負責已注冊品種的口岸檢驗工作。
第三十八條 中國葯品生物製品檢定所負責對進口葯品檢驗工作進行組織、協調和指導，對有爭議的檢驗結果進行技術仲裁，其對進口葯品的技術仲裁結果為最終結論。
第三十九條 進口葯品必須按照《進口葯品注冊證》載明的質量標准，逐批全項檢驗。進口葯品檢驗所需標准品、對照品，由中國葯品生物製品檢定所負責統一制備、標定和分發。《進口葯品檢驗報告書》實行統一格式。
第四十條 進口葯品必須從口岸葯品檢驗所所在城市的口岸組織進口。從其它口岸進口的，各口岸葯品檢驗所不得受理檢驗。
第四十一條 生物製品的進口檢驗，由中國葯品生物製品檢定所負責或國家葯品監督管理局授權的口岸葯品檢驗所負責。
第四十二條 進口葯品到達口岸後，進口單位須填寫《進口葯品報驗單》（附件三），持《進口葯品注冊證》（正本或副本）原件，到所在口岸葯品檢驗所報驗，並報送以下資料：
（一）加蓋進口單位公章的申報品種《進口葯品注冊證》復印件。
（二）加蓋進口單位公章的《葯品經營企業許可證》復印件。
（三）申報品種《進口葯品注冊證》載明的生產國有關部門出具的產地證明原件。
（四）申報品種的購貨合同副本。
（五）申報品種的裝箱單、運單和貨運發票。
（六）申報品種的出廠檢驗報告書。
（七）申報品種的中、英文說明書，包裝、標簽和樣品。
（八）其他有關資料。
預防性生物製品、血液製品，須同時出具國家葯品監督管理局核發的《生物製品進口批件》；進口葯材應同時出具國家葯品監督管理局核發的《進口葯材批件》。
第四十三條 口岸葯品檢驗所在收到《進口葯品報驗單》後，應及時查驗進口單位報送的全部資料，核對葯品數量，符合要求的，發給《進口葯品報驗證明》（附件四）。
第四十四條 海關放行後7日內，進口單位應將已交迄的海關稅單報所在口岸葯品檢驗所，並聯繫到存貨地點現場抽樣。口岸葯品檢驗所應將所有進口貨物數量與海關稅單核對一致並完成抽樣後，簽署《進口葯品抽樣記錄單》（附件五），並將全部貨物予以加封。未經檢驗合格的進口葯品不得擅自拆封、調撥和使用。
進口葯品抽樣，按照國家葯品監督管理局《進口葯品抽樣規定》（附件六）和《進口葯材抽樣規定》（附件七）執行。
第四十五條 口岸葯品檢驗所抽樣後，應及時檢驗，並在規定時間內出具《進口葯品檢驗報告書》。《進口葯品檢驗報告書》應明確標有「符合規定，准予進口」或「不符合規定，不準進口」的檢驗結論。需索賠的，應及時出具英文《進口葯品檢驗報告書》。進口檢驗的樣品留存二年。
第四十六條 對檢驗符合規定的進口葯品，口岸葯品檢驗所應及時啟封，允許調撥、銷售和使用；不符合規定的進口葯品就地封存。
第四十七條 進口單位對檢驗結果有異議時，應在收到《進口葯品檢驗報告書》三十日內向原口岸葯品檢驗所申請復驗；如對復驗結果仍有異議的，可在收到復驗結果三十日內向中國葯品生物製品檢定所申請仲裁檢驗。
未申請復驗或經仲裁仍不合格的，不合格葯品由存貨地省級葯品監督管理局監督處理。
第四十八條 對檢出的不合格進口葯品，各口岸葯品檢驗所須在7日內將檢驗報告書報國家葯品監督管理局和中國葯品生物製品檢定所，同時送其他口岸葯品檢驗所和存貨地省級葯品監督管理局。中國葯品生物製品檢定所應在每月第一周將上月不合格進口葯品情況統計匯總後報國家葯品監督管理局。
第四十九條 下列情形之一的進口葯品，其報驗申請將不予受理：
（一）不能提供《進口葯品注冊證》（正本或副本）、及《生物製品進口批件》或《進口葯材批件》原件的；
（二）《進口葯品注冊證》超過有效期30日的；
（三）未提供本次申報品種產地證明原件的；
（四）從事進口業務的單位未取得《葯品經營企業許可證》的；
（五）申報品種的包裝、標簽等與《進口葯品注冊證》不一致的；
（六）無中文說明書或中文說明書與批準的說明書不一致的；
（七）未在規定口岸進口的；
（八）報驗時，葯品制劑距失效期不滿六個月，原料葯、輔料距失效期不滿十二個月的；
（九）偽造、塗改有關文件和票據的；
（十）其他不符合進口葯品管理有關規定的。
第八章 監督和處罰
第五十條 進口葯品必須在《進口葯品注冊證》載明的生產廠或包裝廠完成生產和最終包裝。不得在其它國家（或地區）進行生產、改換包裝、加貼中文標簽和補裝中文說明書等。違反上述規定的，口岸葯品檢驗所不予受理其已到岸葯品的進口報驗。
第五十一條 國內葯品生產企業、經營企業以及醫療單位采購進口葯品時，供貨單位必須提供《進口葯品注冊證》和《進口葯品檢驗報告書》的復印件，並加蓋供貨單位的公章。
第五十二條 獲得《進口葯品注冊證》的國外製葯廠商，必須按照國家葯品監督管理局葯品不良反應監察管理的有關規定，及時報告進口葯品使用中發生的不良反應，包括在國外發生的不良反應。未按規定報告進口葯品的不良反應而造成的一切後果，由國外製葯廠商負責。
第五十三條 有下列情形之一的進口葯品，禁止銷售、使用：
（一）未取得《進口葯品注冊證》、《生物製品進口批件》或《進口葯材批件》進口的；
（二）偽造、假冒《進口葯品注冊證》、《生物製品進口批件》或《葯材進口批件》進口的；
（三）偽造、假冒《進口葯品檢驗報告書》銷售的。
第五十四條 有下列情形之一的進口葯品，由國家葯品監督管理局對國外製葯廠商提出警告：
（一）進口檢驗一批不合格的；
（二）未及時報告葯品不良反應情況的；
（三）擅自更改包裝和標簽的；
（四）包裝、標簽未註明《進口葯品注冊證》證號以及未用中文註明葯品名稱和主要成分的。
第五十五條 有下列情形之一的進口葯品，由國家葯品監督管理局停止其進口檢驗：
（一）進口檢驗二批以上不合格的；
（二）未及時報告葯品不良反應，造成嚴重後果的；
（三）擅自更改國家葯品監督管理局批準的中文說明書內容的；
（四）被國家葯品監督管理局警告二次以上的（含二次）；
（五）超出《進口葯品注冊證》限定的使用范圍的；
（六）已被國外葯品主管當局停止生產、銷售和使用的；
（七）其它嚴重違反中國葯品管理的法律、法規和規定的。
第九章 附 則
第五十六條 本辦法所稱進口葯品，除原料葯、制劑外，還包括制劑半成品和葯用輔料等。
第五十七條 申報單位對我局進口葯品注冊審批的結論有異議的，可在一月內，逞向國家葯品監督管理局申請復審。
第五十八條 麻醉葯品、精神葯品和放射性葯品的進口管理，按照國務院《麻醉葯品管理辦法》、《精神葯品管理辦法》和《放射性葯品管理辦法》的規定執行。
第五十九條 港、澳、台地區生產的葯品申請向內地銷售、使用的，參照本辦法的規定，經國家葯品監督管理局批准後，核發《醫葯產品注冊證》。
第六十條 申請進口葯品注冊須按照國家有關規定繳費。
第六十一條 本辦法由國家葯品監督管理局負責解釋。
第六十二條 本辦法自1999年5月1日起實施。有關進口葯品的管理規定一律以本辦法為准。
附件一：
進口葯品申報資料細則
一、申報資料必須符合所附《申請進口葯品注冊申報資料》、《申請換發進口葯品注冊證申報資料》和《進口葯品補充申請申報資料》規定的資料項目和編號。
二、《進口葯品注冊申請表》、《換發進口葯品注冊證申請表》需填寫一式三份，《進口葯品補充申請表》需填寫一式二份，除簽字和蓋章外，所有內容必須列印。
三、申報資料必須使用中文或英文，其它文種的資料可附後參考。申報資料必須科學、真實、全面，凡字跡模糊、潦草、難以辨認的，一律不予受理。各類中文翻譯件必須忠實原文，並符合中國的專業規范。
四、申報品種的各類外國政府葯品主管當局證明文件、處方、質量標准、葯品說明書需全部譯成中文，其它各項研究資料須分別提供各項試驗的中文摘要。
五、申報資料須按規定的資料編號順序整理，不同編號的資料單獨裝訂，並在每項資料的封面上註明資料名稱，在右上角註明資料編號。同一資料的中文翻譯件應排在原文之前。全部資料應使用A4紙。
六、新申請注冊品種編號為A0l一A05的資料並《進口葯品注冊申請表》裝訂成一冊，為「第一卷」，申請表排在其它資料之前； A06一Al3項資料裝訂成一冊為「第二卷」； A14一A22項資料為「第三卷」； A23一A26項資料為「第四卷」。換發《進口葯品注冊證》申請以及補充申請的資料，按資料順序，各裝訂為一卷，申請表置於其它資料之前。
申報資料每一卷的封面上應用中文註明申報品種的通用名稱和商品名、生產公司、申請公司、申報日期以及該卷分屬的卷號。各卷首頁應備有本卷資料的中文目錄。
七、A01項資料必須報送原件，應符合世界衛生組織（WHO）推薦的統一格式。必要時，所報文件需經所在國公證機關和駐所在國中國使、領館公證。
1．區域國際組織批准葯品注冊、生產、銷售及符合葯品生產質量管理規范（GMP）的證明文件，經國家葯品監督管理局特別承認，可作為一國的證明文件使用。
2．申報品種在一地完成制劑生產，轉由另一地完成包裝的，須提供包裝廠所在國葯品主管當局簽署的關於該包裝廠符合GMP的證明文件。
3．制劑類申報品種在生產國尚未獲得注冊批准和銷售許可的，可提供其公司總部所在國和其它至少一個國家出具的證明文件，但GMP證明文件必須由生產廠所在國葯品主管當局簽署。
4．原料葯和輔料，按照生產國對此類產品的管理要求，無法提供有關證明文件的，可提供生產國或出口國使用該原料葯、輔料製成制劑的證明文件，或提供本國其它有關政府部門出具的證明該品確已上市銷售供葯用的證明文件。
5．申請進口注冊的原料葯或制劑半成品為專供中國國內葯品生產企業用於生產一類新葯，且該企業已獲得國內葯品生產批准文號，其注冊和銷售的政府證明文件可報送我國批准該葯的新葯證書和新葯批件的復印件，其GMP證明文件和出口證明必須由國外生產廠所在國葯品主管當局簽署。
6．部分非處方葯（OTC）和醫療營養葯品無法提供國家級證明文件的，可按生產國和出口國的法律規定，提供相應級別政府部門的證明文件。
八、國外製葯廠商在中國尚未設立辦事機構的，必須選定中國代理商代理申報，其A02、H02項資料應報送國外製葯廠商授權中國代理商代理申報的授權文書、公證文件及其中文譯本，並附中國代理商的工商執照復印件。
如國外製葯廠商已在中國設立辦事機構，則該辦事機構可直接申報，其A02、H02項資料應報送中國工商管理部門核發的該辦事機構《外國企業常駐中國代表機構登記證》復印件。
九、首次申報的原料葯或制劑半成品，必須報送全部技術資料，其中A23、 A24項資料可報送用本原料葯或制劑半成品製成制劑的試驗資料。
已有同類品種進口注冊的原料葯或制劑半成品， A14一A22項資料可報送文獻資料， A23、A24項資料必須報送用本原料葯或制劑半成品製成制劑的試驗資料，不得僅使用文獻資料。
十、首次申報的葯品制劑，必須報送規定的全部技術資料，不得僅使用文獻資料。
已有同類品種進口注冊的葯品制劑， A14一A22項資料可報送文獻資料， A23、A24項資料必須報送所申請品種的試驗資料，不得僅使用文獻資料。
十一、申請注冊葯用輔料，除單獨使用輔料無法進行的試驗項目外，應參照本細則的資料要求報送資料。
十二、傳統葯物和天然葯物的A06、H03項資料應詳細註明處方中所用每一原植（動）物或礦物的來源，分屬的科、屬、種和拉丁名、英文名。
十三、申報進口注冊的原料葯和輔料， A07、H04項資料必須詳細說明其生產工藝和生產流程。
十四、生物製品的A09、 H06項資料應包括生產檢定用菌毒種、細胞株以及生產檢定用動物、主要原材料等技術資料。
十五、Al2、 H09項資料為擁有申報品種上市權公司質量控制部門的實驗室所作檢驗的報告，由質控部門的負責人簽字生效。
十六、A13項資料為申報注冊品種三批樣品室溫留樣的穩定性試驗資料和加速試驗的穩定性試驗資料。必須包括全部試驗數據，如質量檢驗報告書和定性、定量色譜分析圖譜等。
十七、疫苗製品的Al4項資料包括免疫學資料。
十八、 A23項資料，包括臨床試驗及人體生物利用度／生物等效性試驗資料，其中臨床資料應為I期、II期和III期試驗資料，包括臨床試驗方案和統計方法；IV期臨床試驗資料可申報作為參考。
十九、A24、H10項資料必須提供生產國葯品主管當局批準的英文說明書並附中文譯本。中文說明書必須嚴格按照英文說明書的內容翻譯，並符合中國的專業規范。如英文不是生產國官方文字，無法提供英文資料的，則必須提供生產國葯品主管當局批準的原文說明書，同時須提供其英文譯本和中文說明書。
二十、A25、H13項資料為該葯品在國外市場上所使用的包裝、標簽和說明書實樣，不包括葯品本身； A26、H14項資料為國外市場上所銷售葯品的實樣，包括包裝、標簽、葯品本身和包裝盒內的說明書。
二十一、補充申請中有關政府證明文件和技術資料的要求，按照上述規定執行。
申請進口葯品注冊申報資料項目
A0l 葯品生產國國家葯品主管當局批准葯品注冊、生產、銷售、出口及其生產廠符合葯品生產質量管理規范（GMP)的證明文件、公證文件及其中文譯本
A02 國外製葯廠商授權中國代理商代理申報的授權文書、公證文件及其中文譯本，中國代理商的工商執照復印件；國外製葯廠商常駐中國代表機構登記證復印件
A03 葯品專利證明文件
A04 該葯品在國外的生產、銷售和使用情況，生產廠基本概況以及申請在中國注冊需特別說明的理由及其中文譯本
A05 葯品各項研究結果的綜述及其中文譯本
A06 葯品成分和／或處方組成及其中文譯本
A07 葯品生產工藝及其中文譯本
A08 葯品質量標准和檢驗方法及其中文譯本
A09 制劑用原料葯的質量標准和檢驗方法及其中文譯本
A10 所用輔料的質量標准和檢驗方法及其中文譯本
A11 直接接觸葯品的包裝材料的質量標准和檢驗方法及其中文譯本
A12 三批葯品的質量檢驗報告書
A13 穩定性試驗資料
Al4 主要葯效學試驗資料
A15 一般葯理研究資料
Al6 急性毒性試驗資料
Al7 長期毒性試驗資料
Al8 致突變試驗資料
A19 生殖毒性試驗資料
A20 致癌試驗資料
A21 依賴性試驗資料
A22 動物葯代動力學資料
A23 葯品臨床研究資料
A24 葯品生產國國家葯品主管當局批準的英文說明書（或原文說明書）及其中文譯本
A25 葯品包裝、標簽和說明書實樣
A26 葯品實樣和其它資料
申請換發《進口葯品注冊證》申報資料項目
H01 葯品生產國國家葯品主管當局批准葯品注冊、生產、銷售、出口及其生產廠符合葯品生產質量管理規范（GMP）的證明文件、公證文件及其中文譯本
H02 國外製葯廠商授權中國代理商代理申報的授權文書、公證文件及其中文譯本，中國代理商的工商執照復印件；國外製葯廠商常駐中國代表機構登記證復印件
H03 葯品現行處方組成及其中文譯本
H04葯品現行生產工藝及其中文譯本
H05 葯品現行質量標准和檢驗方法及其中文譯本
H06 制劑用原料葯現行的質量標准和檢驗方法及其中文譯本
H07 所用輔料的現行質量標准和檢驗方法及其中文譯本
H08 直接接觸葯品的現行包裝材料的質量標准和檢驗方法及其中文譯本
H09 近期三批葯品的質量檢驗報告書
Hl0 葯品生產國國家葯品主管當局批準的現行英文說明書（或原文說明書）及其中文譯本
H11 《

Ⅳ 救命神器ECMO的前世今生

席捲中國的新型冠狀病毒之戰，讓救命神器「ECMO」名聲大噪。

1月22日，武漢大學中南醫院用ECMO成功救治了一名「新型冠狀病毒肺炎」重症患者，屬全省首例。

1月23日，81套ECMO設備耗材從德國加急進口，星夜飛馳武漢金銀潭醫院的戰場。

衛健委公布的第五版診療方案中，提出有條件的危重症患者應盡快使用ECMO。

國家衛健委第五版診療方案（2月8日印發）

ECMO，英文全稱 Extracorporeal Membrane Oxygenation，中文名「體外膜肺氧合」，簡稱「人工膜肺」，最核心的部分是膜肺和血泵，分別起人工肺和人工心的作用。

我們第一次聽說ECMO可能更早，那是18年2月的網路爆文《流感下的北京中年》。

作者的岳父因為小小的感冒，輾轉多家醫院，被確診為不明病毒感染的肺炎，27天後陰陽兩隔。

從這篇文章里，我們看到了不明病毒感染、血氧飽和度下降、大白肺、呼吸衰竭、ECMO，和新冠肺炎患者的關鍵詞如此相似。

更普遍的，是每年冬春的甲乙流感導致的肺炎。他們和新冠肺炎都屬於同一個類別：病毒性肺炎。

2018年1月底的廣州，37歲的王女士（化名），受涼後咳嗽發燒，吃葯無好轉。2月5日，王女士因氣促胸悶，前往暨南大學第一醫院就診。胸片顯示雙肺炎症，肺下部出現白色，當天住院治療。首先是輸液和吸氧。

為什麼要吸氧？因為肺功能變的很弱，正常呼吸不能提供足夠氧氣。吸入純氧，受損的肺才能給人體提供最低限度的氧氣，維持大腦和重要器官的存活。

王女士的病情變化迅速，即使高流量吸氧，她的血氧指數最高才78%，遠低於95%的安全值。當天晚上，王女士轉入ICU病房。

ICU的第一招是無創呼吸機，勉強將她的血氧值維持在90%的「臨界水平」。

病情繼續惡化，ICU用了第二招「氣管插管」，用上有創呼吸機後，仍然難以維持王女士的「氧需」，她的血氧一路降到70%到80%。

入院第48小時，王女士胸片影像已成「大白肺」。正常的肺是黑色影像，但因為嚴重炎症，她的肺顯示白茫茫一片。

肺部已基本失去功能，如果不能快速改善，她的大腦和各個器官可能因「缺氧」衰竭，甚至導致死亡。

王女士的生命危在旦夕，經與家屬溝通，2月8日凌晨1點，王女士用上了救命神器ECMO，用來替代她的肺，醫護人員在股靜脈處插管，將靜脈血引流到體外，經過「人工肺」氧合，再將血液泵入體內。

中日醫院詹慶元教授在「呼吸界」的訪談中說，病毒性重症感冒的治療原則有3個：

一是 原發病 治療，主要指抗病毒治療。

二是 支持治療 ，呼吸支持最重要。

三是 並發症和合並症 的治療。

王女士的原發病是流感，有對症的抗病毒葯物比如奧司他韋。雖然並發腎衰竭，感染鮑曼不動桿菌，但醫生用腎臟替代療法（CRRT）和抗生素一一解決，有驚無險。

從高流量吸氧-無創呼吸機-有創呼吸機-ECMO人工肺，這個頂級的呼吸支持神器，為治療爭取到寶貴時間。18天後，王女士順利撤機，直到康復出院。

如果原發病沒有對症葯物，就像新冠肺炎和北京流感中的未知病毒肺炎，ECMO的作用是支持免疫系統和病毒直接對抗，類似「焦土策略」。

新冠病毒像蝗蟲，侵佔了肺部這塊農田，引起免疫系統對病毒和細胞無差別的攻擊，肺部成為一片焦土，病毒也最終死去。

好的結局是，ECMO代替肺維系著患者的生命。病毒死去後，肺部休養生息後，恢復供氧。

不好的結局是，免疫系統實施「焦土策略」時過度攻擊，引發「炎症風暴」，導致肝腎等多器官衰竭，就如李文亮醫生，或者北京中年中的岳父，合並耐葯細菌嚴重感染；他們失去了寶貴的生命。

面對病毒性肺炎引起的呼吸窘迫症，ECMO作為頂級的呼吸支持手段，病毒和並發症的治療決定戰局。

據世界生命支持組織ELSO統計，ECMO的搶救成功率約50%。百分比背後，是一條條鮮活生命，一個個溫暖家庭，一城一池也要奪。

另一個被廣泛報道的ECMO用途是治療爆發性心肌炎。

爆發性心肌炎是一種非常凶險的疾病，高發於小孩和40歲以下青壯年。發生率低，但死亡率高達70%。初始症狀很像普通感冒，但病情進展相當兇猛，短時間內即可產生嚴重心臟損害，極易猝死。

2009年，一個爆發性心肌炎的11歲男孩被送到杭州第一人民醫院。這個男孩送到醫院時已經沒了心跳。經過多輪CPR無效後，醫生們想到了ECMO。

給孩子做上ECMO之後，他的心電監護還是一條直線，但意識居然是清楚的。ICU胡煒主任清楚得記得，那天孩子躺在病床上，身上插滿了大大小小的管子。

忽然，孩子睜眼說了一句：「媽媽，我想喝可樂！」守在一旁的父母頓時淚如雨下。很快，孩子病情好轉，撤機出院。

ECMO常用有V-V模式和V-A模式。

V-V模式是人工肺，用在急性呼吸窘迫綜合征，比如得了病毒性肺炎的王女士。

V-A模式是心肺聯合，用在心臟（心肺）衰竭的患者，比如得了爆發性心肌炎的男孩。還可以用在心臟修復手術、ECPR(體外心肺復甦)等。

最早的ECMO就用在心臟手術上。

它的原型來自美國心臟外科專家約翰·吉本發明的體外循環機。

1980年美國密歇根大學巴萊醫生建立了首個ECMO中心，從此救命神器走出了手術室。

現任台北市長柯文哲，是大中華區推廣ECMO第一人，他曾在台大醫學院用「葉克膜」（台灣說法），將心臟功能喪失的「無心」病人生命維系了16天，然後做心臟移植救活。

本世紀初，柯文哲教授來大陸多家頂級心胸外科傳授ECMO技術，包括北京阜外、安貞、上海胸科醫院等。03年非典期間，ECMO開始在國內用於呼吸衰竭的患者。

ECMO作為頂級救命神器，即使公立三甲醫院，也不是每家都有。好奇心驅使，我研究了魔都醫院的情況。

根據上海體外循環專委會的相關報道，2018年上海有21家醫院開展了ECMO技術，其中有18家公立三甲，而18年上海三甲醫院的數量是38家。

上海有5家醫院較早開展這項技術，ECMO的治療病例也最多。他們是：上海胸科、仁濟、中山、兒童醫學中心、長海。

既然是搶救危重症的救命技術，為什麼沒有廣泛開展？除了技術門檻高，還因為ECMO的昂貴。

ECMO的當天開機費用6萬左右。

其中機器和耗材5萬，穿刺管路和膜肺都從國外進口。還有穿刺操作費、化驗費和葯費，合計不到1萬。

每天ECMO的維持費用是2千。其中人工肺的運轉費用1千，化驗和葯費不到1千。

而重症患者一般都在ICU病房，每天費用也在1-2萬。

ECMO費用加上ICU費用，就有了網上說的，ECMO開機6萬，每天2萬的說法。ECMO基本不進醫保，需要自費。

有位疑似新冠肺炎的黃岡孕婦，在ICU住了一周多，使用ECMO搶救，治療花了近20萬。借的錢花光了，她老公決定放棄治療。

她去世時，老公和醫生都哭了，因為她是有可能治好的。放棄的第二天，國家宣布為新冠病人提供免費治療。

這個令人悲傷的困境本可以用幾百元的保費打破。市面上幾款暢銷的普通百萬醫療和中端醫療險，大多能報銷ECMO費用。

在醫療記錄片里，時常看到醫生的無奈和眼淚，有時是因為醫療技術的局限，更多是高額費用拷問的人心。

為了保護家人，需要提前做好安排。萬一天有不測風雲，我們可以堅定的對醫生說，請用上救命神器ECMO。

參考資料：

（1）搜狐"CSTCVS": 2018年上海市首次ECMO專項技術質量控制督查風采 2018-12-05

（2）網路學術：2018年上海市體外膜氧合專項技術質控督查報告

（3）財新網重症科醫生親述：我們是怎樣搶救危重病人的 2020-02-05

（4）搜狐「丁香園」：醫生救人，就只是讓人活著嗎？2018-11-13

（5）呼吸界：詹慶元教授用經典病例告訴你救治重症流感的獨家秘方 2018-01-14

（7）南方+：感冒6天成「大白肺」！ECMO助廣州青年逃離死亡線 2018-02-28

（8）央視新聞網：重症肺炎孕婦去世：花光借來的20來萬後放棄治療 2020-01-29

Ⅳ 請教：肝昏迷的診斷標準是什麼血氨的測定在其診斷中所處的地位在應激狀態下，血氨是否會升高

在急性肝炎病情發展階段，如出現神志改變或昏迷，則診斷比較容易。如肝硬化患者有明顯肝功能失代償的症狀，或病史中有過門靜脈分流手術，或近期有上消化道大量出血、感染、大量利尿、應用麻醉鎮靜葯等誘因，肝性腦病的診斷也不難作出，此時如發現撲擊樣震顫和血氨增高，則可以肯定診斷 空腹動脈血氨比較穩定可靠，慢性肝性腦病尤其是門體分流性腦病多有血氨升高；急性肝衰竭所致的腦病，血氨多正常。 polanyi丁香園榮譽會員 -------------------------------------------------------------------- 同意kepple的意見。補充幾點： 1、所問為肝昏迷還是肝性腦病？hepatic coma和hepatic encephalopathy（HE）在概念上還是有所不同。後者大於前者，按West Haven criteria分的0-4級，若有coma，已經是4級肝性腦病。此時，按kepple所提診斷依據較好。 2、若有已知有明確肝硬化或門脈高壓及門體分流的基礎，或急性肝衰竭，加上進展性腦病表現，撲擊樣震顫陽性，肝性腦病已可臨床診斷。血氨增高有利於門體分流性HE診斷。 3、subclinical hepatic encephalopathy(SHE)在肝硬化患者中的發生率約30-84%。SHE由於通常僅有有智力檢測和誘發電位的異常，而無腦病臨床表現，常規的精神和神經功能檢查正常。因此很容易被忽略。腦誘發電位不知道你那裡有沒有做。如果沒有的話可使用一些智力測試試驗，如數字連接試驗、圖畫連接、數字元號試驗和搭積木試驗等來代替。雖然SHE還沒有統一的標准，一般來說，智力試驗及腦誘發電位中有一項以上異常者可以診斷SHE。特別要注意對有肝硬化或TIPPS等門體分流基礎的患者，若智力試驗提示異常，還是可以用乳果糖等進行試驗性治療的。 4、關於血氨測定，檢測質控非常重要。對於診斷有幫助，但對隨訪價值不如神經精神異常評估。 5、要除外其他可能的腦病原因，如代謝、感染、腦實質病變等。 polanyi 丁香園榮譽會員 -------------------------------------------------------------------- 血氨在應激狀態下應該不會，尤其在肝功能尚可代償的條件下，血氨的清除還是很迅速的。 xiule 修樂 丁香園准中級站友 --------------------------------------------------------------------- 血氨在肝性腦病病人的診斷中並不是一個很好的診斷方法。有研究指出，並不是每位病人的血氨水平都升高；經過治療，血氨降低，病人的情況也並不見得好轉。 littleboy 丁香園准中級站友 --------------------------------------------------------------------- 個人認為血氨對HE沒有多少價值，臨床肝硬化患者血氨與HE的相關性不是很好。但是我們可以認為血氨升高可能會影響腦細胞代謝而引起腦功能障礙，不過不一定是肝源性的血氨升高。 孤獨求教 -------------------------------------------------------------------- 肝昏迷一定要有肝病基礎，血氨不能作為確診依據。 zl9841 -------------------------------------------------------------------- 同意孤獨的意見。 fdj0289 ------------------------------------------------------------------- 肝功能正常並能完全排除HE，尤其該患有血氨異常，請注意有無特發的門體分流情況。 wolf7174 我們科有許多的肝性腦病的病人，血氨並不升高，但患者出現腦病症狀，經治療後症狀好轉，血氨有時可有所上升。我個人認為血氨對肝性腦病無診斷意義。

Ⅵ 實時熒光Taqman 探針設計的幾個要點

熒光探針法是用序列特異的熒游標記探針來檢測產物，探針法的出現使得定量PCR技術的特異性比常規PCR技術大大提高。目前較常提及的有TaqMan探針、FRET雜交 探針(熒光共振能量傳遞探針)和分子信標Molecular Beacon。

廣泛使用的TaqMan探針法是指PCR擴增時在加入一對引物 的同時另外加入一個特異性的熒光探針，該探針只與模板特異性地結合，其結合位點在兩條引物之間。探針的5′端標記有熒光報告基團(Reporter, R)，如FAM、VIC等，3′端標記有熒光淬滅基團(Quencher, Q)，如TAMRA等。當探針完整的時候，5′端報告基團經儀器光源激發的熒光正好被近距離的3′端熒光基團淬滅，儀器檢測不到5′端報告基團所激發的熒光信號(就是說5』熒光基團的發射波長正好是3』 熒光基團的吸收波長，因譽悶絕而能量被吸收傳遞到3』熒光基團而發出其它熒光)。隨著PCR的進行，Taq酶在鏈延伸過程中遇到與模板結合的探針，其5′-3′外切酶活性(此活性是雙鏈罩冊特異性的，游離的單鏈探針不受影響)就會將切割探針，釋放5′端報告基團游離於反應體系中，遠離3′端熒光淬滅基團的屏蔽，5′端報告基團受激發所發射的熒光信號就可以被探頭檢測到。也就是說每擴增一條 DNA 鏈，就有一個熒光分子形成，實現了熒光信號的累積與PCR產物形成完全同步。報告信號的強度就代表了模板DNA的拷貝數。

(請注意，該圖顯示的不是普通的Taqman探針法，而是Taqman MGB探針法)Taqman探針檢測的是積累熒光。常用的熒光基團有FAM，TET，VIC，HEX等等。當探針完整的時候，由於3′端的熒光淬滅基團在吸收5′端報告基團所發射的熒光能量，本身會發射波長不同的熒光而導致本底高，因此TaqMan探針近來又有新的發展——TaqMan MGB探針。MGB探針的淬滅基團採用非熒光淬滅基團(Non-Fluorescent Quencher)，本身不產生熒光，可以大大降低本底信號的強度。同時探針上還連接有MGB (Minor Groove Binder)修飾基團，可以將探針的Tm值提高10°C左右。因此為了獲得同樣的Tm值，MGB探針可以比普通TaqMan探針設計得更短，既降低了合成成本，也使得探針設計的成功率大為提高——因慶姿為在模板的DNA鹼基組成不理想的情況下，短的探針比長的更容易設計。實驗證明，TaqMan MGB探針對於富含A/T的模板可以區分得更為理想。

Taqman探針法已經得到廣泛使用，不過有人認為這種技術利用了Taq酶5 —3 外切酶活性，一般 試劑 廠家只給Taq酶的聚合酶活性定標，沒有同時給Taq酶5 —3 外切酶活性定標，不同批號試劑之間會給定量帶來差異。另外對探針的熔點溫度(Tm)僅要求其高於60°C，這就使不同 試劑盒 之間的特異性參差不齊，難於做質控檢測。

Real time PCR Taqman探針設計、實時多重PCR探針的選擇和引物的設計及評價

一、實時熒光Taqman 探針設計

總原則：探針選擇要保守，引物選擇要保守，因此必須找一段100-200bp相對要保守的片段來設計引物與探針。即real-time PCR的擴增片段是50bp----150bp。當找不到150bp的保守片段時，必須確保探針的片段是保守的。

在設計探針和引物時，要同時考慮在兩條鏈上設計引物與探針。但要注意的是：在那條鏈上設計探針時，就應靠近在同一條鏈上設計的引物(即上游引物)。這樣，可保證在將來擴增時，即便沒有完全擴增，也有熒光信號報告出來。兩者的距離最好是探針的5』端離上游引物的3』有一個鹼基，但也可以重疊。

若在原序列中找不到合適的探針與引物(1主要是探針和上游引物的距離太遠，而離下游引物的距離卻較近時;2 突變 位點要求在探針的5』 端也能檢測到熒光信號，但卻是在3』端)，可在互補的序列中設計引物與探針。

另real-time PCR中的探針和引物的Tm值，均要高於平常PCR的引物和雜交的探針的Tm值。

二、 探針的設計

探針設計的基本原則：

1. 保守：探針要絕對的保守，有時分型就單獨依靠探針來決定。理論上有一個鹼基不配對，就可能檢測不出來。若找不到完全保守的片段，也只能選取有一個鹼基不同的片段。且這個不同的鹼基最好在探針的中間，對探針與目的片段的雜交影響不大，不相同的鹼基最好不要在兩端，因為兩端不利於探針的雜交。且最好為A或T，而不能為G或A，因為A、T為雙鍵，而G、A為三鍵。

2. 探針長度:Taqman探針的長度最好在25-32bp之間，且Tm值在68-72℃之間，最好為70℃，確保探針的Tm值要比引物的Tm值高出10℃，這樣可保證探針在煺火時先於引物與目的片段結合。因此探針最好是富含GC的保守片段，保證其的Tm值較高。現在有Taqman MGB探針，在TAMER之後再標記一個MGB，可使探針的Tm值較高,即使探針片段較短，也可達到Taqman探針的Tm值要求(68-70℃)。

3. 探針的名稱:應標記探針在 基因 組的位置及長度。

4. 探針Tm值計算: 用oligo或primer preiemer軟體即可計算Tm值。確保探針中GC含量在30-80%。應避免探針中多個重復的鹼基出現，尤其是要避免4個或超過4個的G鹼基出現。

5. 探針的評價:用DNAstar軟體中的Primerselect軟體，點擊「log」菜單中的「create primer catalog」，在「name」中輸入探針的名稱、位置，按Tab鍵進入「sequence」，粘貼或輸入要分析的探針序列。選中整個序列後，在 「report」菜單下「primer self dimer」,分析探針的二聚體。彈出的窗口中就告訴此探針有多少個dimer，並對此探針用dG值進行評價(通常給出最差的dG值，理論上是dG值越大越好)。在「report」菜單下「primer hairpins」,分析探針的發夾結構。彈出的窗口中就告訴此探針有多少個hairpins，並對此探針的hairpins進行評價。多重熒光PCR 時，要對多條探針進行「pair dimer」進行分析。

6. 探針的5』端不能為G，因為即使單個G鹼基與FAM熒光報告基團相連時，G可以淬滅FAM基團所發出的熒光信號，從而導致假陰性的出現。

7. Taqman探針與引物之間的位置:Taqman探針應靠近上游引物，即Taqman探針應靠近與其在同一條鏈上的上游引物。兩者的距離最好是探針的5』 端離上游引物的3』有一個鹼基，但也可以重疊，要保證Taqman探針的5』端離上游引物的5』端至少有4bp。

如：

forward primer Taqman probe

5』 → 3』 5』 FAM→3』染料

NNNNNNN NNNNNNN

發表序列：5』--3』

互補發表序列 3』--5』

NNNNNNN

3』 ←5』

reverse primer

或：

reverse primer

5』 → 3』

NNNNNNN

發表序列： 5』--3』

互補發表序列 3』--5』

NNNNNNN NNNNNNN

料染3』 ← MAF5』 3 』← 5』

Taqman probe forward primer

Taqman probe forward primer

三 引物的設計

1. 上下游引物要保守

為了能夠擴增出所需要的保守片段，必須對保守的100-200片段進行PCR擴增。所以引物的選取也要非常的保守，最好不要有不同的鹼基，若不得不有時，也必須保證引物的3』端至少有4個鹼基是完全保守才可。

在設計保守引物時，要在發表序列上分別找保守一致的區域，即在發表序列的5』端引物位置找的是3』端至少有5個bp保守，在即在發表序列的3』端引物位置找的是5』端至少有5個bp保守。

5』NNNNNNN 3』

發表序列：5』--3』

3』NNNNNNNNN 5』

2. 上下游引物的長度和Tm值

上下游引物的長度一般為18-25bp之間，且Tm值在58-60℃之間。確保引物中GC含量在30-80%。應避免引物中多個重復的鹼基出現，尤其是要避免4個或超過4個的G鹼基出現。引物的3』端最好不為G或/和C。引物3』端的5個鹼基不應出現2個G或/和C。

上游引物應標記F(forword)，且在 基因組 的位置及長度;下游引物應標記R(reverse)，且在基因組的位置及長度。用oligo或 primer preiemer軟體即可計算Tm值。上下游引物的Tm值相差最好不超過2℃，長度相差最好不超過4bp。

3. 引物的評價

用DNAstar軟體中的Primerselect軟體，點擊「log」菜單中的「create primer catalog」，在「name」中輸入引物的名稱、位置，按Tab鍵進入「sequence」，粘貼或輸入要分析的引物序列。選中整個序列後，在 「report」菜單下「primer self dimer」,分析引物的二聚體。彈出的窗口中就告訴此引物有多少個dimer，並對此引物用dG值進行評價(通常給出最差的dG值，理論上是dG值越大越好)。在「report」菜單下「primer hairpins」,分析引物的發夾結構。彈出的窗口中就告訴此引物有多少個hairpins，並對此引物的hairpins進行評價。再選擇所需要的上下游引物，在「report」菜單下「primer pair dimers」,分析上下游引物的dimers。彈出的窗口中就告訴此對引物有多少個dimer，並對此對引物用dG值進行評價(通常給出最差的dG值，理論上是dG值越大越好(dG值通常為負值)，絕對值超過4.5kcal/mol易導致產生引物二聚體帶，並且降低引物有效濃度而使PCR 反應不能正常進行)。不必考慮引物與探針之間的配對與發夾結構，因為探針的Tm值非常之高。

4. 上下游引物與探針的距離(上下游引物的位置)

理論上講，上游引物的3』端離探針的5』端為1-20bp，最佳是1bp，最近為上游引物的3』端離探針的3』端為4bp;下游引物要與探針有一定的距離，但要保證下游引物的3』端離探針的3』端最為15-150bp。整個目的片段的長度最好在50-150bp之間，最長不超過200bp。

5. 簡並引物的設計

當為了能夠同時擴增即使在引物位點也有突變的目的片段，若多個鹼基出現的概率相同，就要在此位點，設計一個代表多個鹼基的簡並子。在合成引物時，在合成到此位點時，就不是加入一個鹼基，而是同時加入簡並子所代表的多個鹼基。這樣，實質合成的引物是多條引物，只不過是在簡並子位置鹼基不同而已。但簡並引物要考慮每條引物的Tm值，確保簡並子所代表的不同鹼基的不同引物Tm值相差不超過2℃。若超過2℃，在確保引物的3』端引物相同時，在Tm值較低的鹼基引物的5』端加入幾個鹼基，使其的Tm值相同。但這時就不是簡並引物，而是分別合成長度不同，簡並子位點鹼基不同，但Tm值相同的兩條引物，最後在進行等濃度的混合即可。

5』 → 3』

NNNANNN

NNNGNNN

序列：5』-NNNNNNNNNA/GNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-3』

R

R

四、 實時多重PCR探針的選擇

1.多重實時PCR的多種含意有兩種：一為選擇保守的探針和引物，利用不同的染料標記探針，在檢測時可根據熒光的顏色來判定不同的產物。另一種為選擇保守的引物，擴增不同長度的目的片段，反應中加入SYBRN染料，最後根據不同目的片段的Tm值來判定不同的物品。

2.多重實時PCR的熒光探針應為同一類型：如同時為Taqman 探針、或同時為MGB探針、或同時為Beacon 探針。

3.MGB探針的優點

a.MGB探針較短(14-20bp)，更容易找到所有排序序列的較短片段的保守區。

b.短片段探針(14-20bp)加上MGB 後，Tm值將提高10℃，更容易達到熒光探針Tm值的要求。

4.MGB探針的設計原則

1)探針的5』端避免出現G，即使探針水解為單個鹼基，與報告基團相相連的G鹼基仍可淬滅基團的熒光信號。

2)用 primerexpress軟體評價Tm值，Tm值應為65-67℃。

3)盡量縮短Taqman MGB探針，但探針長度不少於13bp。

4)盡量避免出現重復的鹼基，尤其是G鹼基，應避免出現4個或4個以上的G重復出現。

5)原則上MGB探針只要有一個鹼基突變，MGB探針就會檢測到(MGB探針將不會與目的片段雜交，不產生熒光信號)。因此，在進行SNP檢測時，為了檢測到突變子，即Taqman MGB不與目的片段雜交，不產生熒光信號，探針目的片段產生熒光信號檢測將探針的突變位點盡量放在中間1/3的地方。注意：為了滿足上述要求的4個條件，探針的突變位點可向3』端移動，但突變位點至少在離3』端2個鹼基的前方(即必須確保探針的後兩個鹼基是絕對的保守)，以進行SNP檢測。反過來，若要進行同類檢測，找的是保守片段區，探針中不應有突變位點。若探針即便是只有13個bp,探針仍不完全保守。有幾個突變，突變位點也應靠近探針的5』端，這樣，即便是突變，探針也可與目的片段雜交，產生熒光信號。另一種方法是設計簡並探針，也可達到即使是突變，仍可檢測到突變。

5.在多重PCR中，多重PCR的各個引物之間相互干擾和各個探針之間相互干擾分析

設計好各對引物和探針後，重新在用DNAstar軟體中的Primerselect軟體，打開保守在同一文件中的多重PCR的引物文件，然後兩兩分別選中所設計的多重引物或兩兩分別選中所設計的多重探針後，在「report」菜單下「primer pair dimers」,分析上下游引物的dimers。彈出的窗口中就告訴此對引物有多少個dimer，並對此對引物用dG值進行評價(通常給出最差的dG值，理論上是dG值越大越好)。

6.多重實時熒光PCR擴增片段影響

最好每重擴增相同長度的目的片段，但長度不以相差太大。

7.同種亞型明顯分為幾群，而又想同時擴增整個亞型的引物與探針設計策略。

先對各個亞群設計各自保守的引物與探針，然後探針用同一染料標記，這樣在實時PCR反應中，雖然是多重PCR反應，但報告卻是同一個染料報告。

採用熒游標記探針檢測產物的特異性比較強，TaqMan探針是熒光定量PCR中常用的熒光探針，一般TaqMan探針5′端的熒游標記基團是FAM、VIC等，TaqMan探針3′端熒游標記集團為TAMRA、Quencher等

參考：丁香園