丁香园质控

Ⅰ 请教：肝昏迷的诊断标准是什么血氨的测定在其诊断中所处的地位在应激状态下，血氨是否会升高

在急性肝炎病情发展阶段，如出现神志改变或昏迷，则诊断比较容易。如肝硬化患者有明显肝功能失代偿的症状，或病史中有过门静脉分流手术，或近期有上消化道大量出血、感染、大量利尿、应用麻醉镇静药等诱因，肝性脑病的诊断也不难作出，此时如发现扑击样震颤和血氨增高，则可以肯定诊断 空腹动脉血氨比较稳定可靠，慢性肝性脑病尤其是门体分流性脑病多有血氨升高；急性肝衰竭所致的脑病，血氨多正常。 polanyi丁香园荣誉会员 -------------------------------------------------------------------- 同意kepple的意见。补充几点： 1、所问为肝昏迷还是肝性脑病？hepatic coma和hepatic encephalopathy（HE）在概念上还是有所不同。后者大于前者，按伏答West Haven criteria分的0-4级，若有coma，已经是4级肝性脑病。此时，按kepple所提诊断依据较好。 2、若有已知有明确肝硬化或门脉高压及门体分流的基础，或急性肝衰竭，加上进展性脑病表现，扑击样震颤阳性，肝性脑病已可临床诊断。血氨增高有利于门体分流性HE诊断。 3、subclinical hepatic encephalopathy(SHE)在肝硬化患者中的发生率约30-84%。SHE由于通常仅有有智力检测和诱发电位的异常，而无脑病临床表现，常规的精神和神经功能检查正常。因此很容易被忽略。脑诱发电位不知道你那里有没有做。如果没有的话可使用一些智力测试试验，如数字连接试验、图画连接、数字符号试验和搭积木试验等来代替。虽然SHE还没有统一的标准，一般来说，智力试验及脑诱发电位中有一项以上异常者可以诊断SHE。特别要注意对有肝硬化或TIPPS等门体分流基础的患者，若智力试验提示异族厅纤常，还是可以用乳果糖等进行试验性治疗的。 4、关于血氨测定，检测质控非常重要。对于诊断有帮助，但对随访价值不如神经精神异常评估。 5、要除外其他可能的脑病原因，如代谢、感染、脑实质病变等。 polanyi 丁香园荣誉会员 -------------------------------------------------------------------- 血氨在应激状态下应该不会，尤其在肝功能尚可代偿的条件下，血氨的清除还是很迅速的。 xiule 修乐 丁香园准中级站友 --------------------------------------------------------------------- 血氨在肝性脑病病人的诊断中并不是一个很好的诊断方法。有研究指出，并不是每位病人的血氨水平都升高；经过治疗，血氨降低，病人的情况也并不见得好转。 littleboy 丁香园准中级站友 --------------------------------------------------------------------- 个人认为血氨对HE没有多少价值，临床肝硬化患者血氨与HE的相关性不是很好。但是我们可以认为血氨升高可能会影响脑细胞代谢而引起脑功能障碍，不过不一定是肝源性的血氨升高。 孤独求教 -------------------------------------------------------------------- 肝昏迷一定要有肝病基础，血氨不能作为确诊依据。 zl9841 -------------------------------------------------------------------- 同意孤独的意见。 fdj0289 ------------------------------------------------------------------- 肝功能正常并能完全排除HE，尤其该患有血氨异常，请注意有无特发的门体分流兆仿情况。 wolf7174 我们科有许多的肝性脑病的病人，血氨并不升高，但患者出现脑病症状，经治疗后症状好转，血氨有时可有所上升。我个人认为血氨对肝性脑病无诊断意义。

Ⅱ 医学生毕业后如果不当医生还可以做些什么

1. 做医学科普。比如漫画啦，或者写科普文章啦，考个营养师证什么的，做做与大众息息相关的东西。

2. 医学律师。目前国内这一块很缺乏，你可以帮医院打官司，也可以帮病人。

3. .私人诊所。这个比较难了，需要经验，而且，各种执照什么的也挺难办的。

4. 去做医药代表。

5. 去做医托。在你曾经待过的医院有一定的人脉，可以带人看病，帮人预约检查，挂专家号，给人做医疗方面的解答啦。
   
   
   

Ⅲ 进口药品批件如何办理

上丁香园问吧 此处专业人士少

进口药品管理办法
(国家药品监督管理局令第6号)
第一章 总 则
第一条 为加强进口药品的监督管理，保证进口药品的质量和安全有效，根据《中华人民共和国药品管理法》的规定，制定本办法。
第二条 国家对进口药品实行注册审批制度。进口药品必须取得中华人民共和国国家药品监督管理局核发的《进口药品注册证》，并经国家药品监督管理局授权的口岸药品检验所检验合格。
第三条 国家药品监督管理局主管进口药品的审批和监督管理工作，地方各级药品监督管理部门主管辖区内进口药品的监督管理工作。
第四条 进口药品必须符合《中华人民共和国药品管理法》和中国其它有关法律法规的规定，必须接受国家药品监督管理局对其生产情况的监督检查。
第五条 进口药品必须是临床需要、安全有效、质量可控的品种。
第二章 申报和注册审批
第六条 申请注册的进口药品必须获得生产国国家药品主管当局注册批准和上市许可。
第七条 进口药品的生产厂必须符合所在国药品生产质量管理规范和中国药品生产质量管理规范（GMP）的要求，必要时须经国家药品监督管理局核查，达到与所生产品种相适应的生产条件和管理水平。
第八条 进口药品注册，须由国外制药厂商驻中国的办事机构或其在中国的注册代理提出申请，填写《进口药品注册证申请表》，连同本办法规定的资料，报国家药品监督管理局审批。
国外制药厂商驻中国的办事机构或其在中国的注册代理必须是在中国工商行政管理部门登记的合法机构。
第九条 申请进口药品注册，须报送以下资料：
（一）药品生产国国家药品主管当局批准药品注册、生产、销售、出口及其生产厂符合药品生产质量管理规范（GMP）的证明文件和公证文件。
（二）国外制药厂商授权中国代理商代理申报的证明文件，中国代理商的工商执照复印件；国外制药厂商常驻中国代表机构登记证复印件。
（三）药品专利证明文件。
（四）药品生产国国家药品主管当局批准的药品说明书。
（五）药品质量标准和检验方法。
（六）药品各项研究结果的综述。
（七）药品处方、生产工艺、药理、毒理及临床研究等详细技术资料。
（八）药品及包装实样和其他资料。
申报资料的具体要求，按照本办法所附《进口药品申报资料细则》（附件一）的规定执行。
第十条 申请注册的进口药品，必须按照本办法所附《进口药品质量复核规则》（附件二）的要求和程序进行质量复核。
第十一条 申请注册的进口药品，必须按照国家药品监督管理局规定的程序和要求在中国进行临床研究（包括生物等效性试验）。其中申请注册的原料药若中国尚未生产，则应用该原料药制成的制剂在中国进行临床研究。临床研究须按照中国《新药审批办法》及《药品临床试验管理规范》（GCP）的规定执行。特殊病种或其它情况需减免临床研究的，需经国家药品监督管理局审查批准。
第十二条 申报品种的质量复核和临床研究结束后，国家药品监督管理局对有关资料进行审查，符合要求的，核发《进口药品注册证》。该品种的质量标准即成为进口药品注册标准，中文说明书为指导进口药品在中国临床使用的法定说明书。
第十三条 对特殊病种的治疗药物，在中国尚没有其它替代药物的情况下，国家药品监督管理局可采取加快审批措施。
第十四条 中国重大灾情、疫情所需药品，临床特需、急需药品，捐赠药品和研究用样品等，在尚未取得《进口药品注册证》的情况下，可经国家药品监督管理局特别批准进口。此类药品仅限在特定范围内用于特定目的。
第十五条 下列情形之一的药品，其进口注册申请将不予批准：
（一）不符合本办法第六条和第七条规定的；
（二）申报资料不符合中国进口药品注册审批要求的；
（三）临床使用中存在严重不良反应的；
（四）临床疗效不确切或所报临床研究资料无法说明药品的确切疗效的；
（五）质量标准及检验方法不完善，质量指标低于中国国家药品标准、中国生物制品规程或国际通用药典以及已注册同类品种的企业标准的；
（六）含有中国禁止进口的成份的；
（七）其他不符合中国有关法律、法规和规定的。
第三章 进口药品注册证
第十六条 《进口药品注册证》是国家药品监督管理局核发的允许国外生产的药品在中国注册、进口和销售使用的批准文件。国家药品监督管理局各口岸药品检验所凭《进口药品注册证》接受报验。
第十七条 《进口药品注册证》分为正本和副本，自发证之日起，有效期三年。
第十八条 《进口药品注册证》按统一格式编号，为注册证号。注册证号由字母X（Z或S）后接八位阿拉伯数字组成，前四位为公元年号，后四位为年内顺序编号；其中Z代表中药，S代表生物制品，X代表化学药品。
第十九条 《进口药品注册证》规定以下内容：药品通用名称、商品名、主要成分、剂型。规格、包装规格、药品有效期；公司、生产厂名称及地址；注册证有效期、检验标准、注册证证号、批准时间、发证机关及印鉴等。
批准注册品种的每个不同规格，分别核发《进口药品注册证》；每个《进口药品注册证》最多登载二个包装规格。
第二十条 《进口药品注册证》只对载明的内容有效，其任何内容的改变必须报国家药品监督管理局审核批准。
第二十一条 对部分批准进口注册的原料药、辅料、制剂半成品，国家药品监督管理局将在《进口药品注册证》备注中，限定其使用范围。
第四章 《进口药品注册证》的换发和审批
第二十二条 换发《进口药品注册证》应由国外制药厂商驻中国的办事机构或其在中国的注册代理在注册证期满6个月前，向国家药品监督管理局提出申请。超过注册证有效期的按新申请注册品种管理。
第二十三条 申请换发《进口药品注册证》须填写《换发进口药品注册证申请表》，并报送以下资料：
（一）药品生产国国家药品主管当局签发的批准药品注册、生产、销售、出口及符合药品生产质量管理规范（GMP）的证明文件。
（二）国外制药厂商授权中国代理商代理申报的证明文件，中国代理商的工商执照复印件；国外制药厂商常驻中国代表机构登记证复印件。
（三）药品生产国国家药品主管当局批准的药品说明书及其中文译本。
（四）药品处方、生产工艺、质量标准及检验方法。
（五）《进口药品注册证》有效期内在中国进口、销售情况（包括进口批次、数量、进口口岸等）。
（六）进口药品使用及不良反应情况的总结报告。
（七）药品及包装实样和其他资料。
申报资料的具体要求，按《进口药品申报资料细则》的规定执行。
第二十四条 药品处方中辅料、生产工艺、质量标准和说明书等有变化的，须同时报送以下资料：
（一）修改理由及其说明。
（二）生产国国家药品主管当局批准此项修改的证明文件。
（三）此项修改所依据的实验研究资料。
第二十五条 国家药品监督管理局对申请换发《进口药品注册证》的品种进行审查，必要时，可安排质量考核或临床再评价，符合要求的，批准换发《进口药品注册证》，发给新的注册证号。
第二十六条 有下列情形之一的进口药品，其换发《进口药品注册证》申请将不予批准：
（一）发现严重不良反应的；
（二）临床疗效不确切、质量不稳定的；
（三）口岸检验二批不合格的；
（四）已被国家药品监督管理局处罚二次以上的（含二次）；
（五）其他不符合中国有关法律、法规和规定的。
第五章 补充申请
第二十七条 已取得《进口药品注册证》的进口药品，下列情形属补充申请。
（一）《进口药品注册证》注明的通用名称、商品名、公司名称、生产厂名称等改变。
（二）质量标准、生产工艺、有效期等改变。
（三）适应症增加。
（四）说明书内容改变。
（五）包装和标签式样、内容改变。
（六）处方中辅料改变。
（七）产地改换。
（八）药品规格改变或增加。
（九）包装规格改变或增加。
（十）其它与批准注册时申报内容有任何改变的。
第二十八条 补充申请需填写《进口药品补充申请表》，连同《进口药品申报资料细则》规定的补充申请资料，报国家药品监督管理局审查批准。
第二十九条 申请增加适应症，须在中国进行临床试验；药品质量标准改变的，须进行质量标准复核。
第三十条 改换产地、增加药品规格的补充申请，必须在原《进口药品注册证》有效期满至少12个月前提交；不足12个月的，可按照本办法第四章的规定，申请换发《进口药品注册证》，同时申请改换产地、增加药品规格。
改换产地、增加药品规格的补充申请经国家药品监督管理局审查批准后，核发新产地、新增药品规格的《进口药品注册证》，新注册证号为原注册证号前加字母B构成，注册证有效期以原注册证为准。
第三十一条 《进口药品注册证》规定内容的补充申请，如变更包装规格、通用名称、商品名、公司名称、生产厂名称等，国家药品监督管理局审查批准后，核发新的《进口药品注册证》，原注册证即行作废，并由国家药品监督管理局收回；增加包装规格的补充申请，包括进口分装生产所需大包装规格，国家药品监督管理局审查批准后核发新的《进口药品注册证》，原注册证可继续使用。
新注册证号为原注册证号前加字母B构成，注册证有效期以原注册证为准。
第三十二条 进口药品中文说明书和质量标准的补充申请，经国家药品监督管理局审查批准后，下发修订后的说明书和质量标准，原说明书和质量标准即行废止。
第三十三条 进口药品的包装、标签的式样和内容仅有微小改变的，应向国家药品监督管理局申报备案。
第六章 药品名称、包装、标签和说明书
第三十四条 进口药品必须使用中文药品名称，必须符合中国药品命名原则的规定。
第三十五条 进口药品的包装和标签，必须用中文注明药品名称、主要成分以及注册证号，进口药品必须使用中文说明书。
第三十六条 进口药品的包装、标签和说明书，必须符合中国《药品包装、标签和说明书管理规定》，并经国家药品监督管理局批准后使用。一经批准，其内容不得擅自更改。
第七章 进口检验
第三十七条 国家药品监督管理局根据进口药品管理工作的需要，设立口岸药品检验所，负责已注册品种的口岸检验工作。
第三十八条 中国药品生物制品检定所负责对进口药品检验工作进行组织、协调和指导，对有争议的检验结果进行技术仲裁，其对进口药品的技术仲裁结果为最终结论。
第三十九条 进口药品必须按照《进口药品注册证》载明的质量标准，逐批全项检验。进口药品检验所需标准品、对照品，由中国药品生物制品检定所负责统一制备、标定和分发。《进口药品检验报告书》实行统一格式。
第四十条 进口药品必须从口岸药品检验所所在城市的口岸组织进口。从其它口岸进口的，各口岸药品检验所不得受理检验。
第四十一条 生物制品的进口检验，由中国药品生物制品检定所负责或国家药品监督管理局授权的口岸药品检验所负责。
第四十二条 进口药品到达口岸后，进口单位须填写《进口药品报验单》（附件三），持《进口药品注册证》（正本或副本）原件，到所在口岸药品检验所报验，并报送以下资料：
（一）加盖进口单位公章的申报品种《进口药品注册证》复印件。
（二）加盖进口单位公章的《药品经营企业许可证》复印件。
（三）申报品种《进口药品注册证》载明的生产国有关部门出具的产地证明原件。
（四）申报品种的购货合同副本。
（五）申报品种的装箱单、运单和货运发票。
（六）申报品种的出厂检验报告书。
（七）申报品种的中、英文说明书，包装、标签和样品。
（八）其他有关资料。
预防性生物制品、血液制品，须同时出具国家药品监督管理局核发的《生物制品进口批件》；进口药材应同时出具国家药品监督管理局核发的《进口药材批件》。
第四十三条 口岸药品检验所在收到《进口药品报验单》后，应及时查验进口单位报送的全部资料，核对药品数量，符合要求的，发给《进口药品报验证明》（附件四）。
第四十四条 海关放行后7日内，进口单位应将已交迄的海关税单报所在口岸药品检验所，并联系到存货地点现场抽样。口岸药品检验所应将所有进口货物数量与海关税单核对一致并完成抽样后，签署《进口药品抽样记录单》（附件五），并将全部货物予以加封。未经检验合格的进口药品不得擅自拆封、调拨和使用。
进口药品抽样，按照国家药品监督管理局《进口药品抽样规定》（附件六）和《进口药材抽样规定》（附件七）执行。
第四十五条 口岸药品检验所抽样后，应及时检验，并在规定时间内出具《进口药品检验报告书》。《进口药品检验报告书》应明确标有“符合规定，准予进口”或“不符合规定，不准进口”的检验结论。需索赔的，应及时出具英文《进口药品检验报告书》。进口检验的样品留存二年。
第四十六条 对检验符合规定的进口药品，口岸药品检验所应及时启封，允许调拨、销售和使用；不符合规定的进口药品就地封存。
第四十七条 进口单位对检验结果有异议时，应在收到《进口药品检验报告书》三十日内向原口岸药品检验所申请复验；如对复验结果仍有异议的，可在收到复验结果三十日内向中国药品生物制品检定所申请仲裁检验。
未申请复验或经仲裁仍不合格的，不合格药品由存货地省级药品监督管理局监督处理。
第四十八条 对检出的不合格进口药品，各口岸药品检验所须在7日内将检验报告书报国家药品监督管理局和中国药品生物制品检定所，同时送其他口岸药品检验所和存货地省级药品监督管理局。中国药品生物制品检定所应在每月第一周将上月不合格进口药品情况统计汇总后报国家药品监督管理局。
第四十九条 下列情形之一的进口药品，其报验申请将不予受理：
（一）不能提供《进口药品注册证》（正本或副本）、及《生物制品进口批件》或《进口药材批件》原件的；
（二）《进口药品注册证》超过有效期30日的；
（三）未提供本次申报品种产地证明原件的；
（四）从事进口业务的单位未取得《药品经营企业许可证》的；
（五）申报品种的包装、标签等与《进口药品注册证》不一致的；
（六）无中文说明书或中文说明书与批准的说明书不一致的；
（七）未在规定口岸进口的；
（八）报验时，药品制剂距失效期不满六个月，原料药、辅料距失效期不满十二个月的；
（九）伪造、涂改有关文件和票据的；
（十）其他不符合进口药品管理有关规定的。
第八章 监督和处罚
第五十条 进口药品必须在《进口药品注册证》载明的生产厂或包装厂完成生产和最终包装。不得在其它国家（或地区）进行生产、改换包装、加贴中文标签和补装中文说明书等。违反上述规定的，口岸药品检验所不予受理其已到岸药品的进口报验。
第五十一条 国内药品生产企业、经营企业以及医疗单位采购进口药品时，供货单位必须提供《进口药品注册证》和《进口药品检验报告书》的复印件，并加盖供货单位的公章。
第五十二条 获得《进口药品注册证》的国外制药厂商，必须按照国家药品监督管理局药品不良反应监察管理的有关规定，及时报告进口药品使用中发生的不良反应，包括在国外发生的不良反应。未按规定报告进口药品的不良反应而造成的一切后果，由国外制药厂商负责。
第五十三条 有下列情形之一的进口药品，禁止销售、使用：
（一）未取得《进口药品注册证》、《生物制品进口批件》或《进口药材批件》进口的；
（二）伪造、假冒《进口药品注册证》、《生物制品进口批件》或《药材进口批件》进口的；
（三）伪造、假冒《进口药品检验报告书》销售的。
第五十四条 有下列情形之一的进口药品，由国家药品监督管理局对国外制药厂商提出警告：
（一）进口检验一批不合格的；
（二）未及时报告药品不良反应情况的；
（三）擅自更改包装和标签的；
（四）包装、标签未注明《进口药品注册证》证号以及未用中文注明药品名称和主要成分的。
第五十五条 有下列情形之一的进口药品，由国家药品监督管理局停止其进口检验：
（一）进口检验二批以上不合格的；
（二）未及时报告药品不良反应，造成严重后果的；
（三）擅自更改国家药品监督管理局批准的中文说明书内容的；
（四）被国家药品监督管理局警告二次以上的（含二次）；
（五）超出《进口药品注册证》限定的使用范围的；
（六）已被国外药品主管当局停止生产、销售和使用的；
（七）其它严重违反中国药品管理的法律、法规和规定的。
第九章 附 则
第五十六条 本办法所称进口药品，除原料药、制剂外，还包括制剂半成品和药用辅料等。
第五十七条 申报单位对我局进口药品注册审批的结论有异议的，可在一月内，逞向国家药品监督管理局申请复审。
第五十八条 麻醉药品、精神药品和放射性药品的进口管理，按照国务院《麻醉药品管理办法》、《精神药品管理办法》和《放射性药品管理办法》的规定执行。
第五十九条 港、澳、台地区生产的药品申请向内地销售、使用的，参照本办法的规定，经国家药品监督管理局批准后，核发《医药产品注册证》。
第六十条 申请进口药品注册须按照国家有关规定缴费。
第六十一条 本办法由国家药品监督管理局负责解释。
第六十二条 本办法自1999年5月1日起实施。有关进口药品的管理规定一律以本办法为准。
附件一：
进口药品申报资料细则
一、申报资料必须符合所附《申请进口药品注册申报资料》、《申请换发进口药品注册证申报资料》和《进口药品补充申请申报资料》规定的资料项目和编号。
二、《进口药品注册申请表》、《换发进口药品注册证申请表》需填写一式三份，《进口药品补充申请表》需填写一式二份，除签字和盖章外，所有内容必须打印。
三、申报资料必须使用中文或英文，其它文种的资料可附后参考。申报资料必须科学、真实、全面，凡字迹模糊、潦草、难以辨认的，一律不予受理。各类中文翻译件必须忠实原文，并符合中国的专业规范。
四、申报品种的各类外国政府药品主管当局证明文件、处方、质量标准、药品说明书需全部译成中文，其它各项研究资料须分别提供各项试验的中文摘要。
五、申报资料须按规定的资料编号顺序整理，不同编号的资料单独装订，并在每项资料的封面上注明资料名称，在右上角注明资料编号。同一资料的中文翻译件应排在原文之前。全部资料应使用A4纸。
六、新申请注册品种编号为A0l一A05的资料并《进口药品注册申请表》装订成一册，为“第一卷”，申请表排在其它资料之前； A06一Al3项资料装订成一册为“第二卷”； A14一A22项资料为“第三卷”； A23一A26项资料为“第四卷”。换发《进口药品注册证》申请以及补充申请的资料，按资料顺序，各装订为一卷，申请表置于其它资料之前。
申报资料每一卷的封面上应用中文注明申报品种的通用名称和商品名、生产公司、申请公司、申报日期以及该卷分属的卷号。各卷首页应备有本卷资料的中文目录。
七、A01项资料必须报送原件，应符合世界卫生组织（WHO）推荐的统一格式。必要时，所报文件需经所在国公证机关和驻所在国中国使、领馆公证。
1．区域国际组织批准药品注册、生产、销售及符合药品生产质量管理规范（GMP）的证明文件，经国家药品监督管理局特别承认，可作为一国的证明文件使用。
2．申报品种在一地完成制剂生产，转由另一地完成包装的，须提供包装厂所在国药品主管当局签署的关于该包装厂符合GMP的证明文件。
3．制剂类申报品种在生产国尚未获得注册批准和销售许可的，可提供其公司总部所在国和其它至少一个国家出具的证明文件，但GMP证明文件必须由生产厂所在国药品主管当局签署。
4．原料药和辅料，按照生产国对此类产品的管理要求，无法提供有关证明文件的，可提供生产国或出口国使用该原料药、辅料制成制剂的证明文件，或提供本国其它有关政府部门出具的证明该品确已上市销售供药用的证明文件。
5．申请进口注册的原料药或制剂半成品为专供中国国内药品生产企业用于生产一类新药，且该企业已获得国内药品生产批准文号，其注册和销售的政府证明文件可报送我国批准该药的新药证书和新药批件的复印件，其GMP证明文件和出口证明必须由国外生产厂所在国药品主管当局签署。
6．部分非处方药（OTC）和医疗营养药品无法提供国家级证明文件的，可按生产国和出口国的法律规定，提供相应级别政府部门的证明文件。
八、国外制药厂商在中国尚未设立办事机构的，必须选定中国代理商代理申报，其A02、H02项资料应报送国外制药厂商授权中国代理商代理申报的授权文书、公证文件及其中文译本，并附中国代理商的工商执照复印件。
如国外制药厂商已在中国设立办事机构，则该办事机构可直接申报，其A02、H02项资料应报送中国工商管理部门核发的该办事机构《外国企业常驻中国代表机构登记证》复印件。
九、首次申报的原料药或制剂半成品，必须报送全部技术资料，其中A23、 A24项资料可报送用本原料药或制剂半成品制成制剂的试验资料。
已有同类品种进口注册的原料药或制剂半成品， A14一A22项资料可报送文献资料， A23、A24项资料必须报送用本原料药或制剂半成品制成制剂的试验资料，不得仅使用文献资料。
十、首次申报的药品制剂，必须报送规定的全部技术资料，不得仅使用文献资料。
已有同类品种进口注册的药品制剂， A14一A22项资料可报送文献资料， A23、A24项资料必须报送所申请品种的试验资料，不得仅使用文献资料。
十一、申请注册药用辅料，除单独使用辅料无法进行的试验项目外，应参照本细则的资料要求报送资料。
十二、传统药物和天然药物的A06、H03项资料应详细注明处方中所用每一原植（动）物或矿物的来源，分属的科、属、种和拉丁名、英文名。
十三、申报进口注册的原料药和辅料， A07、H04项资料必须详细说明其生产工艺和生产流程。
十四、生物制品的A09、 H06项资料应包括生产检定用菌毒种、细胞株以及生产检定用动物、主要原材料等技术资料。
十五、Al2、 H09项资料为拥有申报品种上市权公司质量控制部门的实验室所作检验的报告，由质控部门的负责人签字生效。
十六、A13项资料为申报注册品种三批样品室温留样的稳定性试验资料和加速试验的稳定性试验资料。必须包括全部试验数据，如质量检验报告书和定性、定量色谱分析图谱等。
十七、疫苗制品的Al4项资料包括免疫学资料。
十八、 A23项资料，包括临床试验及人体生物利用度／生物等效性试验资料，其中临床资料应为I期、II期和III期试验资料，包括临床试验方案和统计方法；IV期临床试验资料可申报作为参考。
十九、A24、H10项资料必须提供生产国药品主管当局批准的英文说明书并附中文译本。中文说明书必须严格按照英文说明书的内容翻译，并符合中国的专业规范。如英文不是生产国官方文字，无法提供英文资料的，则必须提供生产国药品主管当局批准的原文说明书，同时须提供其英文译本和中文说明书。
二十、A25、H13项资料为该药品在国外市场上所使用的包装、标签和说明书实样，不包括药品本身； A26、H14项资料为国外市场上所销售药品的实样，包括包装、标签、药品本身和包装盒内的说明书。
二十一、补充申请中有关政府证明文件和技术资料的要求，按照上述规定执行。
申请进口药品注册申报资料项目
A0l 药品生产国国家药品主管当局批准药品注册、生产、销售、出口及其生产厂符合药品生产质量管理规范（GMP)的证明文件、公证文件及其中文译本
A02 国外制药厂商授权中国代理商代理申报的授权文书、公证文件及其中文译本，中国代理商的工商执照复印件；国外制药厂商常驻中国代表机构登记证复印件
A03 药品专利证明文件
A04 该药品在国外的生产、销售和使用情况，生产厂基本概况以及申请在中国注册需特别说明的理由及其中文译本
A05 药品各项研究结果的综述及其中文译本
A06 药品成分和／或处方组成及其中文译本
A07 药品生产工艺及其中文译本
A08 药品质量标准和检验方法及其中文译本
A09 制剂用原料药的质量标准和检验方法及其中文译本
A10 所用辅料的质量标准和检验方法及其中文译本
A11 直接接触药品的包装材料的质量标准和检验方法及其中文译本
A12 三批药品的质量检验报告书
A13 稳定性试验资料
Al4 主要药效学试验资料
A15 一般药理研究资料
Al6 急性毒性试验资料
Al7 长期毒性试验资料
Al8 致突变试验资料
A19 生殖毒性试验资料
A20 致癌试验资料
A21 依赖性试验资料
A22 动物药代动力学资料
A23 药品临床研究资料
A24 药品生产国国家药品主管当局批准的英文说明书（或原文说明书）及其中文译本
A25 药品包装、标签和说明书实样
A26 药品实样和其它资料
申请换发《进口药品注册证》申报资料项目
H01 药品生产国国家药品主管当局批准药品注册、生产、销售、出口及其生产厂符合药品生产质量管理规范（GMP）的证明文件、公证文件及其中文译本
H02 国外制药厂商授权中国代理商代理申报的授权文书、公证文件及其中文译本，中国代理商的工商执照复印件；国外制药厂商常驻中国代表机构登记证复印件
H03 药品现行处方组成及其中文译本
H04药品现行生产工艺及其中文译本
H05 药品现行质量标准和检验方法及其中文译本
H06 制剂用原料药现行的质量标准和检验方法及其中文译本
H07 所用辅料的现行质量标准和检验方法及其中文译本
H08 直接接触药品的现行包装材料的质量标准和检验方法及其中文译本
H09 近期三批药品的质量检验报告书
Hl0 药品生产国国家药品主管当局批准的现行英文说明书（或原文说明书）及其中文译本
H11 《

Ⅳ 救命神器ECMO的前世今生

席卷中国的新型冠状病毒之战，让救命神器“ECMO”名声大噪。

1月22日，武汉大学中南医院用ECMO成功救治了一名“新型冠状病毒肺炎”重症患者，属全省首例。

1月23日，81套ECMO设备耗材从德国加急进口，星夜飞驰武汉金银潭医院的战场。

卫健委公布的第五版诊疗方案中，提出有条件的危重症患者应尽快使用ECMO。

国家卫健委第五版诊疗方案（2月8日印发）

ECMO，英文全称 Extracorporeal Membrane Oxygenation，中文名“体外膜肺氧合”，简称“人工膜肺”，最核心的部分是膜肺和血泵，分别起人工肺和人工心的作用。

我们第一次听说ECMO可能更早，那是18年2月的网络爆文《流感下的北京中年》。

作者的岳父因为小小的感冒，辗转多家医院，被确诊为不明病毒感染的肺炎，27天后阴阳两隔。

从这篇文章里，我们看到了不明病毒感染、血氧饱和度下降、大白肺、呼吸衰竭、ECMO，和新冠肺炎患者的关键词如此相似。

更普遍的，是每年冬春的甲乙流感导致的肺炎。他们和新冠肺炎都属于同一个类别：病毒性肺炎。

2018年1月底的广州，37岁的王女士（化名），受凉后咳嗽发烧，吃药无好转。2月5日，王女士因气促胸闷，前往暨南大学第一医院就诊。胸片显示双肺炎症，肺下部出现白色，当天住院治疗。首先是输液和吸氧。

为什么要吸氧？因为肺功能变的很弱，正常呼吸不能提供足够氧气。吸入纯氧，受损的肺才能给人体提供最低限度的氧气，维持大脑和重要器官的存活。

王女士的病情变化迅速，即使高流量吸氧，她的血氧指数最高才78%，远低于95%的安全值。当天晚上，王女士转入ICU病房。

ICU的第一招是无创呼吸机，勉强将她的血氧值维持在90%的“临界水平”。

病情继续恶化，ICU用了第二招“气管插管”，用上有创呼吸机后，仍然难以维持王女士的“氧需”，她的血氧一路降到70%到80%。

入院第48小时，王女士胸片影像已成“大白肺”。正常的肺是黑色影像，但因为严重炎症，她的肺显示白茫茫一片。

肺部已基本失去功能，如果不能快速改善，她的大脑和各个器官可能因“缺氧”衰竭，甚至导致死亡。

王女士的生命危在旦夕，经与家属沟通，2月8日凌晨1点，王女士用上了救命神器ECMO，用来替代她的肺，医护人员在股静脉处插管，将静脉血引流到体外，经过“人工肺”氧合，再将血液泵入体内。

中日医院詹庆元教授在“呼吸界”的访谈中说，病毒性重症感冒的治疗原则有3个：

一是 原发病 治疗，主要指抗病毒治疗。

二是 支持治疗 ，呼吸支持最重要。

三是 并发症和合并症 的治疗。

王女士的原发病是流感，有对症的抗病毒药物比如奥司他韦。虽然并发肾衰竭，感染鲍曼不动杆菌，但医生用肾脏替代疗法（CRRT）和抗生素一一解决，有惊无险。

从高流量吸氧-无创呼吸机-有创呼吸机-ECMO人工肺，这个顶级的呼吸支持神器，为治疗争取到宝贵时间。18天后，王女士顺利撤机，直到康复出院。

如果原发病没有对症药物，就像新冠肺炎和北京流感中的未知病毒肺炎，ECMO的作用是支持免疫系统和病毒直接对抗，类似“焦土策略”。

新冠病毒像蝗虫，侵占了肺部这块农田，引起免疫系统对病毒和细胞无差别的攻击，肺部成为一片焦土，病毒也最终死去。

好的结局是，ECMO代替肺维系着患者的生命。病毒死去后，肺部休养生息后，恢复供氧。

不好的结局是，免疫系统实施“焦土策略”时过度攻击，引发“炎症风暴”，导致肝肾等多器官衰竭，就如李文亮医生，或者北京中年中的岳父，合并耐药细菌严重感染；他们失去了宝贵的生命。

面对病毒性肺炎引起的呼吸窘迫症，ECMO作为顶级的呼吸支持手段，病毒和并发症的治疗决定战局。

据世界生命支持组织ELSO统计，ECMO的抢救成功率约50%。百分比背后，是一条条鲜活生命，一个个温暖家庭，一城一池也要夺。

另一个被广泛报道的ECMO用途是治疗爆发性心肌炎。

爆发性心肌炎是一种非常凶险的疾病，高发于小孩和40岁以下青壮年。发生率低，但死亡率高达70%。初始症状很像普通感冒，但病情进展相当凶猛，短时间内即可产生严重心脏损害，极易猝死。

2009年，一个爆发性心肌炎的11岁男孩被送到杭州第一人民医院。这个男孩送到医院时已经没了心跳。经过多轮CPR无效后，医生们想到了ECMO。

给孩子做上ECMO之后，他的心电监护还是一条直线，但意识居然是清楚的。ICU胡炜主任清楚得记得，那天孩子躺在病床上，身上插满了大大小小的管子。

忽然，孩子睁眼说了一句：“妈妈，我想喝可乐！”守在一旁的父母顿时泪如雨下。很快，孩子病情好转，撤机出院。

ECMO常用有V-V模式和V-A模式。

V-V模式是人工肺，用在急性呼吸窘迫综合征，比如得了病毒性肺炎的王女士。

V-A模式是心肺联合，用在心脏（心肺）衰竭的患者，比如得了爆发性心肌炎的男孩。还可以用在心脏修复手术、ECPR(体外心肺复苏)等。

最早的ECMO就用在心脏手术上。

它的原型来自美国心脏外科专家约翰·吉本发明的体外循环机。

1980年美国密歇根大学巴莱医生建立了首个ECMO中心，从此救命神器走出了手术室。

现任台北市长柯文哲，是大中华区推广ECMO第一人，他曾在台大医学院用“叶克膜”（台湾说法），将心脏功能丧失的“无心”病人生命维系了16天，然后做心脏移植救活。

本世纪初，柯文哲教授来大陆多家顶级心胸外科传授ECMO技术，包括北京阜外、安贞、上海胸科医院等。03年非典期间，ECMO开始在国内用于呼吸衰竭的患者。

ECMO作为顶级救命神器，即使公立三甲医院，也不是每家都有。好奇心驱使，我研究了魔都医院的情况。

根据上海体外循环专委会的相关报道，2018年上海有21家医院开展了ECMO技术，其中有18家公立三甲，而18年上海三甲医院的数量是38家。

上海有5家医院较早开展这项技术，ECMO的治疗病例也最多。他们是：上海胸科、仁济、中山、儿童医学中心、长海。

既然是抢救危重症的救命技术，为什么没有广泛开展？除了技术门槛高，还因为ECMO的昂贵。

ECMO的当天开机费用6万左右。

其中机器和耗材5万，穿刺管路和膜肺都从国外进口。还有穿刺操作费、化验费和药费，合计不到1万。

每天ECMO的维持费用是2千。其中人工肺的运转费用1千，化验和药费不到1千。

而重症患者一般都在ICU病房，每天费用也在1-2万。

ECMO费用加上ICU费用，就有了网上说的，ECMO开机6万，每天2万的说法。ECMO基本不进医保，需要自费。

有位疑似新冠肺炎的黄冈孕妇，在ICU住了一周多，使用ECMO抢救，治疗花了近20万。借的钱花光了，她老公决定放弃治疗。

她去世时，老公和医生都哭了，因为她是有可能治好的。放弃的第二天，国家宣布为新冠病人提供免费治疗。

这个令人悲伤的困境本可以用几百元的保费打破。市面上几款畅销的普通百万医疗和中端医疗险，大多能报销ECMO费用。

在医疗记录片里，时常看到医生的无奈和眼泪，有时是因为医疗技术的局限，更多是高额费用拷问的人心。

为了保护家人，需要提前做好安排。万一天有不测风云，我们可以坚定的对医生说，请用上救命神器ECMO。

参考资料：

（1）搜狐"CSTCVS": 2018年上海市首次ECMO专项技术质量控制督查风采 2018-12-05

（2）网络学术：2018年上海市体外膜氧合专项技术质控督查报告

（3）财新网重症科医生亲述：我们是怎样抢救危重病人的 2020-02-05

（4）搜狐“丁香园”：医生救人，就只是让人活着吗？2018-11-13

（5）呼吸界：詹庆元教授用经典病例告诉你救治重症流感的独家秘方 2018-01-14

（7）南方+：感冒6天成“大白肺”！ECMO助广州青年逃离死亡线 2018-02-28

（8）央视新闻网：重症肺炎孕妇去世：花光借来的20来万后放弃治疗 2020-01-29

Ⅳ 请教：肝昏迷的诊断标准是什么血氨的测定在其诊断中所处的地位在应激状态下，血氨是否会升高

在急性肝炎病情发展阶段，如出现神志改变或昏迷，则诊断比较容易。如肝硬化患者有明显肝功能失代偿的症状，或病史中有过门静脉分流手术，或近期有上消化道大量出血、感染、大量利尿、应用麻醉镇静药等诱因，肝性脑病的诊断也不难作出，此时如发现扑击样震颤和血氨增高，则可以肯定诊断 空腹动脉血氨比较稳定可靠，慢性肝性脑病尤其是门体分流性脑病多有血氨升高；急性肝衰竭所致的脑病，血氨多正常。 polanyi丁香园荣誉会员 -------------------------------------------------------------------- 同意kepple的意见。补充几点： 1、所问为肝昏迷还是肝性脑病？hepatic coma和hepatic encephalopathy（HE）在概念上还是有所不同。后者大于前者，按West Haven criteria分的0-4级，若有coma，已经是4级肝性脑病。此时，按kepple所提诊断依据较好。 2、若有已知有明确肝硬化或门脉高压及门体分流的基础，或急性肝衰竭，加上进展性脑病表现，扑击样震颤阳性，肝性脑病已可临床诊断。血氨增高有利于门体分流性HE诊断。 3、subclinical hepatic encephalopathy(SHE)在肝硬化患者中的发生率约30-84%。SHE由于通常仅有有智力检测和诱发电位的异常，而无脑病临床表现，常规的精神和神经功能检查正常。因此很容易被忽略。脑诱发电位不知道你那里有没有做。如果没有的话可使用一些智力测试试验，如数字连接试验、图画连接、数字符号试验和搭积木试验等来代替。虽然SHE还没有统一的标准，一般来说，智力试验及脑诱发电位中有一项以上异常者可以诊断SHE。特别要注意对有肝硬化或TIPPS等门体分流基础的患者，若智力试验提示异常，还是可以用乳果糖等进行试验性治疗的。 4、关于血氨测定，检测质控非常重要。对于诊断有帮助，但对随访价值不如神经精神异常评估。 5、要除外其他可能的脑病原因，如代谢、感染、脑实质病变等。 polanyi 丁香园荣誉会员 -------------------------------------------------------------------- 血氨在应激状态下应该不会，尤其在肝功能尚可代偿的条件下，血氨的清除还是很迅速的。 xiule 修乐 丁香园准中级站友 --------------------------------------------------------------------- 血氨在肝性脑病病人的诊断中并不是一个很好的诊断方法。有研究指出，并不是每位病人的血氨水平都升高；经过治疗，血氨降低，病人的情况也并不见得好转。 littleboy 丁香园准中级站友 --------------------------------------------------------------------- 个人认为血氨对HE没有多少价值，临床肝硬化患者血氨与HE的相关性不是很好。但是我们可以认为血氨升高可能会影响脑细胞代谢而引起脑功能障碍，不过不一定是肝源性的血氨升高。 孤独求教 -------------------------------------------------------------------- 肝昏迷一定要有肝病基础，血氨不能作为确诊依据。 zl9841 -------------------------------------------------------------------- 同意孤独的意见。 fdj0289 ------------------------------------------------------------------- 肝功能正常并能完全排除HE，尤其该患有血氨异常，请注意有无特发的门体分流情况。 wolf7174 我们科有许多的肝性脑病的病人，血氨并不升高，但患者出现脑病症状，经治疗后症状好转，血氨有时可有所上升。我个人认为血氨对肝性脑病无诊断意义。

Ⅵ 实时荧光Taqman 探针设计的几个要点

荧光探针法是用序列特异的荧光标记探针来检测产物，探针法的出现使得定量PCR技术的特异性比常规PCR技术大大提高。目前较常提及的有TaqMan探针、FRET杂交 探针(荧光共振能量传递探针)和分子信标Molecular Beacon。

广泛使用的TaqMan探针法是指PCR扩增时在加入一对引物 的同时另外加入一个特异性的荧光探针，该探针只与模板特异性地结合，其结合位点在两条引物之间。探针的5′端标记有荧光报告基团(Reporter, R)，如FAM、VIC等，3′端标记有荧光淬灭基团(Quencher, Q)，如TAMRA等。当探针完整的时候，5′端报告基团经仪器光源激发的荧光正好被近距离的3′端荧光基团淬灭，仪器检测不到5′端报告基团所激发的荧光信号(就是说5’荧光基团的发射波长正好是3’ 荧光基团的吸收波长，因誉闷绝而能量被吸收传递到3’荧光基团而发出其它荧光)。随着PCR的进行，Taq酶在链延伸过程中遇到与模板结合的探针，其5′-3′外切酶活性(此活性是双链罩册特异性的，游离的单链探针不受影响)就会将切割探针，释放5′端报告基团游离于反应体系中，远离3′端荧光淬灭基团的屏蔽，5′端报告基团受激发所发射的荧光信号就可以被探头检测到。也就是说每扩增一条 DNA 链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。报告信号的强度就代表了模板DNA的拷贝数。

(请注意，该图显示的不是普通的Taqman探针法，而是Taqman MGB探针法)Taqman探针检测的是积累荧光。常用的荧光基团有FAM，TET，VIC，HEX等等。当探针完整的时候，由于3′端的荧光淬灭基团在吸收5′端报告基团所发射的荧光能量，本身会发射波长不同的荧光而导致本底高，因此TaqMan探针近来又有新的发展——TaqMan MGB探针。MGB探针的淬灭基团采用非荧光淬灭基团(Non-Fluorescent Quencher)，本身不产生荧光，可以大大降低本底信号的强度。同时探针上还连接有MGB (Minor Groove Binder)修饰基团，可以将探针的Tm值提高10°C左右。因此为了获得同样的Tm值，MGB探针可以比普通TaqMan探针设计得更短，既降低了合成成本，也使得探针设计的成功率大为提高——因庆姿为在模板的DNA碱基组成不理想的情况下，短的探针比长的更容易设计。实验证明，TaqMan MGB探针对于富含A/T的模板可以区分得更为理想。

Taqman探针法已经得到广泛使用，不过有人认为这种技术利用了Taq酶5 —3 外切酶活性，一般 试剂 厂家只给Taq酶的聚合酶活性定标，没有同时给Taq酶5 —3 外切酶活性定标，不同批号试剂之间会给定量带来差异。另外对探针的熔点温度(Tm)仅要求其高于60°C，这就使不同 试剂盒 之间的特异性参差不齐，难于做质控检测。

Real time PCR Taqman探针设计、实时多重PCR探针的选择和引物的设计及评价

一、实时荧光Taqman 探针设计

总原则：探针选择要保守，引物选择要保守，因此必须找一段100-200bp相对要保守的片段来设计引物与探针。即real-time PCR的扩增片段是50bp----150bp。当找不到150bp的保守片段时，必须确保探针的片段是保守的。

在设计探针和引物时，要同时考虑在两条链上设计引物与探针。但要注意的是：在那条链上设计探针时，就应靠近在同一条链上设计的引物(即上游引物)。这样，可保证在将来扩增时，即便没有完全扩增，也有荧光信号报告出来。两者的距离最好是探针的5’端离上游引物的3’有一个碱基，但也可以重叠。

若在原序列中找不到合适的探针与引物(1主要是探针和上游引物的距离太远，而离下游引物的距离却较近时;2 突变 位点要求在探针的5’ 端也能检测到荧光信号，但却是在3’端)，可在互补的序列中设计引物与探针。

另real-time PCR中的探针和引物的Tm值，均要高于平常PCR的引物和杂交的探针的Tm值。

二、 探针的设计

探针设计的基本原则：

1. 保守：探针要绝对的保守，有时分型就单独依靠探针来决定。理论上有一个碱基不配对，就可能检测不出来。若找不到完全保守的片段，也只能选取有一个碱基不同的片段。且这个不同的碱基最好在探针的中间，对探针与目的片段的杂交影响不大，不相同的碱基最好不要在两端，因为两端不利于探针的杂交。且最好为A或T，而不能为G或A，因为A、T为双键，而G、A为三键。

2. 探针长度:Taqman探针的长度最好在25-32bp之间，且Tm值在68-72℃之间，最好为70℃，确保探针的Tm值要比引物的Tm值高出10℃，这样可保证探针在煺火时先于引物与目的片段结合。因此探针最好是富含GC的保守片段，保证其的Tm值较高。现在有Taqman MGB探针，在TAMER之后再标记一个MGB，可使探针的Tm值较高,即使探针片段较短，也可达到Taqman探针的Tm值要求(68-70℃)。

3. 探针的名称:应标记探针在 基因 组的位置及长度。

4. 探针Tm值计算: 用oligo或primer preiemer软件即可计算Tm值。确保探针中GC含量在30-80%。应避免探针中多个重复的碱基出现，尤其是要避免4个或超过4个的G碱基出现。

5. 探针的评价:用DNAstar软件中的Primerselect软件，点击“log”菜单中的“create primer catalog”，在“name”中输入探针的名称、位置，按Tab键进入“sequence”，粘贴或输入要分析的探针序列。选中整个序列后，在 “report”菜单下“primer self dimer”,分析探针的二聚体。弹出的窗口中就告诉此探针有多少个dimer，并对此探针用dG值进行评价(通常给出最差的dG值，理论上是dG值越大越好)。在“report”菜单下“primer hairpins”,分析探针的发夹结构。弹出的窗口中就告诉此探针有多少个hairpins，并对此探针的hairpins进行评价。多重荧光PCR 时，要对多条探针进行“pair dimer”进行分析。

6. 探针的5’端不能为G，因为即使单个G碱基与FAM荧光报告基团相连时，G可以淬灭FAM基团所发出的荧光信号，从而导致假阴性的出现。

7. Taqman探针与引物之间的位置:Taqman探针应靠近上游引物，即Taqman探针应靠近与其在同一条链上的上游引物。两者的距离最好是探针的5’ 端离上游引物的3’有一个碱基，但也可以重叠，要保证Taqman探针的5’端离上游引物的5’端至少有4bp。

如：

forward primer Taqman probe

5’ → 3’ 5’ FAM→3’染料

NNNNNNN NNNNNNN

发表序列：5’--3’

互补发表序列 3’--5’

NNNNNNN

3’ ←5’

reverse primer

或：

reverse primer

5’ → 3’

NNNNNNN

发表序列： 5’--3’

互补发表序列 3’--5’

NNNNNNN NNNNNNN

料染3’ ← MAF5’ 3 ’← 5’

Taqman probe forward primer

Taqman probe forward primer

三 引物的设计

1. 上下游引物要保守

为了能够扩增出所需要的保守片段，必须对保守的100-200片段进行PCR扩增。所以引物的选取也要非常的保守，最好不要有不同的碱基，若不得不有时，也必须保证引物的3’端至少有4个碱基是完全保守才可。

在设计保守引物时，要在发表序列上分别找保守一致的区域，即在发表序列的5’端引物位置找的是3’端至少有5个bp保守，在即在发表序列的3’端引物位置找的是5’端至少有5个bp保守。

5’NNNNNNN 3’

发表序列：5’--3’

3’NNNNNNNNN 5’

2. 上下游引物的长度和Tm值

上下游引物的长度一般为18-25bp之间，且Tm值在58-60℃之间。确保引物中GC含量在30-80%。应避免引物中多个重复的碱基出现，尤其是要避免4个或超过4个的G碱基出现。引物的3’端最好不为G或/和C。引物3’端的5个碱基不应出现2个G或/和C。

上游引物应标记F(forword)，且在 基因组 的位置及长度;下游引物应标记R(reverse)，且在基因组的位置及长度。用oligo或 primer preiemer软件即可计算Tm值。上下游引物的Tm值相差最好不超过2℃，长度相差最好不超过4bp。

3. 引物的评价

用DNAstar软件中的Primerselect软件，点击“log”菜单中的“create primer catalog”，在“name”中输入引物的名称、位置，按Tab键进入“sequence”，粘贴或输入要分析的引物序列。选中整个序列后，在 “report”菜单下“primer self dimer”,分析引物的二聚体。弹出的窗口中就告诉此引物有多少个dimer，并对此引物用dG值进行评价(通常给出最差的dG值，理论上是dG值越大越好)。在“report”菜单下“primer hairpins”,分析引物的发夹结构。弹出的窗口中就告诉此引物有多少个hairpins，并对此引物的hairpins进行评价。再选择所需要的上下游引物，在“report”菜单下“primer pair dimers”,分析上下游引物的dimers。弹出的窗口中就告诉此对引物有多少个dimer，并对此对引物用dG值进行评价(通常给出最差的dG值，理论上是dG值越大越好(dG值通常为负值)，绝对值超过4.5kcal/mol易导致产生引物二聚体带，并且降低引物有效浓度而使PCR 反应不能正常进行)。不必考虑引物与探针之间的配对与发夹结构，因为探针的Tm值非常之高。

4. 上下游引物与探针的距离(上下游引物的位置)

理论上讲，上游引物的3’端离探针的5’端为1-20bp，最佳是1bp，最近为上游引物的3’端离探针的3’端为4bp;下游引物要与探针有一定的距离，但要保证下游引物的3’端离探针的3’端最为15-150bp。整个目的片段的长度最好在50-150bp之间，最长不超过200bp。

5. 简并引物的设计

当为了能够同时扩增即使在引物位点也有突变的目的片段，若多个碱基出现的概率相同，就要在此位点，设计一个代表多个碱基的简并子。在合成引物时，在合成到此位点时，就不是加入一个碱基，而是同时加入简并子所代表的多个碱基。这样，实质合成的引物是多条引物，只不过是在简并子位置碱基不同而已。但简并引物要考虑每条引物的Tm值，确保简并子所代表的不同碱基的不同引物Tm值相差不超过2℃。若超过2℃，在确保引物的3’端引物相同时，在Tm值较低的碱基引物的5’端加入几个碱基，使其的Tm值相同。但这时就不是简并引物，而是分别合成长度不同，简并子位点碱基不同，但Tm值相同的两条引物，最后在进行等浓度的混合即可。

5’ → 3’

NNNANNN

NNNGNNN

序列：5’-NNNNNNNNNA/GNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-3’

R

R

四、 实时多重PCR探针的选择

1.多重实时PCR的多种含意有两种：一为选择保守的探针和引物，利用不同的染料标记探针，在检测时可根据荧光的颜色来判定不同的产物。另一种为选择保守的引物，扩增不同长度的目的片段，反应中加入SYBRN染料，最后根据不同目的片段的Tm值来判定不同的物品。

2.多重实时PCR的荧光探针应为同一类型：如同时为Taqman 探针、或同时为MGB探针、或同时为Beacon 探针。

3.MGB探针的优点

a.MGB探针较短(14-20bp)，更容易找到所有排序序列的较短片段的保守区。

b.短片段探针(14-20bp)加上MGB 后，Tm值将提高10℃，更容易达到荧光探针Tm值的要求。

4.MGB探针的设计原则

1)探针的5’端避免出现G，即使探针水解为单个碱基，与报告基团相相连的G碱基仍可淬灭基团的荧光信号。

2)用 primerexpress软件评价Tm值，Tm值应为65-67℃。

3)尽量缩短Taqman MGB探针，但探针长度不少于13bp。

4)尽量避免出现重复的碱基，尤其是G碱基，应避免出现4个或4个以上的G重复出现。

5)原则上MGB探针只要有一个碱基突变，MGB探针就会检测到(MGB探针将不会与目的片段杂交，不产生荧光信号)。因此，在进行SNP检测时，为了检测到突变子，即Taqman MGB不与目的片段杂交，不产生荧光信号，探针目的片段产生荧光信号检测将探针的突变位点尽量放在中间1/3的地方。注意：为了满足上述要求的4个条件，探针的突变位点可向3’端移动，但突变位点至少在离3’端2个碱基的前方(即必须确保探针的后两个碱基是绝对的保守)，以进行SNP检测。反过来，若要进行同类检测，找的是保守片段区，探针中不应有突变位点。若探针即便是只有13个bp,探针仍不完全保守。有几个突变，突变位点也应靠近探针的5’端，这样，即便是突变，探针也可与目的片段杂交，产生荧光信号。另一种方法是设计简并探针，也可达到即使是突变，仍可检测到突变。

5.在多重PCR中，多重PCR的各个引物之间相互干扰和各个探针之间相互干扰分析

设计好各对引物和探针后，重新在用DNAstar软件中的Primerselect软件，打开保守在同一文件中的多重PCR的引物文件，然后两两分别选中所设计的多重引物或两两分别选中所设计的多重探针后，在“report”菜单下“primer pair dimers”,分析上下游引物的dimers。弹出的窗口中就告诉此对引物有多少个dimer，并对此对引物用dG值进行评价(通常给出最差的dG值，理论上是dG值越大越好)。

6.多重实时荧光PCR扩增片段影响

最好每重扩增相同长度的目的片段，但长度不以相差太大。

7.同种亚型明显分为几群，而又想同时扩增整个亚型的引物与探针设计策略。

先对各个亚群设计各自保守的引物与探针，然后探针用同一染料标记，这样在实时PCR反应中，虽然是多重PCR反应，但报告却是同一个染料报告。

采用荧光标记探针检测产物的特异性比较强，TaqMan探针是荧光定量PCR中常用的荧光探针，一般TaqMan探针5′端的荧光标记基团是FAM、VIC等，TaqMan探针3′端荧光标记集团为TAMRA、Quencher等

参考：丁香园